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Greengard提出顛覆性理論之學術背景

為理解Greengard的研究，我們還需要先來重溫一下糖原合成和代謝的基礎生化知識。糖原（glycogen）是葡萄糖（glucose）的聚合物大分子，是葡萄糖的儲存方式。在我們飽餐一頓之後，血糖水平升高，胰腺分泌胰島素（insulin），胰島素促進葡萄糖合成糖原，儲藏於肝臟和肌肉中，降低血糖水平。

當血糖下降時，胰腺分泌胰高血糖素（glucagon），促進糖原分解，釋放葡萄糖，提高血糖水平；或在應激情況下，如面對恐懼或危險時，腎上腺素（adrenaline）水平飆升，促進肌肉分解糖原，釋放葡萄糖，進入戰鬥或逃跑狀態。

圖15. 糖原合成（左）和分解（右）的關鍵步驟。

胰島素啟用磷酸酶，磷酸酶去磷酸化，啟用糖原合成酶，促進糖原合成；胰高血糖素和腎上腺素啟用cAMP下游激酶，激酶磷酸化，啟用糖原磷酸化酶，促進糖原分解。另外圖中未標出來：胰島素啟用的磷酸酶同時也可以將糖原磷酸化酶去磷酸化，抑制糖原分解；胰高血糖素和腎上腺素啟用cAMP下游激酶，同時也可以將糖原合成酶磷酸化，抑制糖原合成（作者繪圖）。

這些過程中涉及到很多催化酶反應，大多是由上文提到的科裡Cori夫婦及他們的弟子發現的。Cori夫婦首先發現了糖原代謝的第一中間產物葡萄糖-1-磷酸（glucose 1-phosphate，也稱Cori ester酯），Greengard的導師之一Cori夫婦的第一個博士生Colowick 在Cori夫婦指導下發現糖原磷酸化酶（glucogen phosphorylase）。

葡萄糖-1-磷酸同時也是糖原合成的最後中間產物，反過來的反應由糖原合成酶（glycogen synthase）催化。而胰島素、胰高血糖素和腎上腺素則是透過磷酸化（在蛋白上加上一個磷酸基團）和去磷酸化（從蛋白上移走一個磷酸基團）修飾這些酶來啟用或抑制這些酶，從而調控糖原合成和分解。

Greengard的另一位導師（也是Cori的弟子）Sutherland則發現胰高血糖素和腎上腺素透過啟用另一個酶——腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC），從而啟用cAMP訊號通路。他認為所有的激素都是透過啟用cAMP訊號通路來發揮作用，並將cAMP稱為“第二信使”。Sutherland因此獨享了1971年的諾貝爾生理學或醫學獎。

在Greengard成立實驗室的1968年，Cori的另一個弟子Edwin Krebs（和線粒體三羧酸迴圈系統的Krebs不是同一人）和他的合作者Edmond Fischer發現cAMP啟用PKA激酶，並系統的闡述了胰島素等激素如何透過啟用激酶（kinase，在蛋白上加上一個磷酸基團）和磷酸酶（phosphatase，從蛋白上移走一個磷酸基團）來實現上述磷酸化和去磷酸化過程，最終調控糖原合成和分解。Krebs和Fischer共享了1992年的諾貝爾生理學或醫學獎。

圖16. 激酶和磷酸酶分別透過對蛋白磷酸化和去磷酸化來調控酶活、相關的生化反應和細胞活性。

蛋白磷酸化和去磷酸化是個動態平衡的過程（作者繪圖）。

Greengard猜測，慢神經反應跟激素介導的機制類似，只不過在代謝系統，胰島素、胰高血糖素、腎上腺素等是從遠處釋放，經血液迴圈到達目的地和受體結合，而神經遞質則在幾十奈米寬的突觸前細胞膜釋放，與突觸後細胞膜表面的受體快速結合。

進化從來不是一個重新設計的過程，而是將已有的東西重新利用起來。神經系統便是重新利用了代謝系統的這一機制。這也是為什麼慢反應的受體被稱為代謝型受體。Greengard的想法在現在看來再正常不過了，但在當時看來實在太另類了。據Greengard回憶，當時他的朋友們都覺得他瘋了，勸他早日迴歸主流研究。

“Greengard Cascades”：級聯，滾滾而來的新發現

證明自己理論的第一步，Greengard需要證明神經系統中存在著代謝系統中Sutherland命名的“第二信使”cAMP。其實Sutherland等人在研究cAMP的時候就已經發現，在所有物種中，合成cAMP的腺苷酸環化酶AC活性在大腦中最高43。但cAMP在腦中的功能，其生理生化效應還沒人研究。在成立實驗室的第二年（1969年），Greengard發表了第一篇Science文章，用Sutherland和Krebs研究激素誘導糖原分解相同的方法，發現大腦中確實存在大量cAMP，且其生化效應確實也能啟用cAMP依賴的PKA激酶44。

這年夏天，有兩個大四學生想去Greengard實驗室做畢業設計。一般實驗室不太喜歡沒實驗經驗的大學生，但Greengard剛好缺人手，就招了他們。這兩個人一個畢業後留在實驗室讀博士，一個去了哈佛大學（Harvard）讀博士。這個離開的小夥子叫Josh Sanes。Sanes說這是他做的一個糟糕的決定。在哈佛大學，神經科學家都笑話Greengard，在他們看來，大腦高度耗能，大量消耗葡萄糖，自然也就有cAMP，僅此而已45。

要知道當時的哈佛神經生物學系是世上第一個神經生物學系（於1966年成立），甚至神經生物學（neurobiology）這個名字可能都是創系主任、現代神經科學的集大成者Stephen Kuffler在給系起名的時候想出來的。Kuffler將生理學、解剖學和化學的方法統一運用於神經科學的研究。

系裡的神經科學家都是傳統的電生理學家，包括上文提到的研究視覺系統20多年的Hubel和Wiesel（Wiesel於Kuffler之後任系主任，後於1983年和Greengard同年去了洛克菲勒大學，幾年後任校長。在我國成立生命科學改革試驗單位北京生命科學研究所NIBS時，Wiesel還作為學術委員會主席參與了評估）。那年（1970年），Greengard也去哈佛神經生物學系作了報告，大家都同意cAMP訊號通路在大腦代謝里的作用，但沒人相信Greengard的理論——cAMP在神經傳遞中也起著作用。歷史總是驚人的相似，當年“放電派”的Fulton也是說“化學派”研究的乙醯膽鹼只是代謝副產物。回來後，Greengard決定結合生理學，用實驗來回應他們的質疑。

Sanes與“腦彩虹”技術

Sanes現在是哈佛大學教授，“腦彩虹（Brainbow）”的共同發明者之一。著名華人神經科學家、麻省理工大學教授馮國平曾師從Sanes。

圖17. Brainbow技術由幾種熒光蛋白隨機組合，從而使不同神經細胞被不同熒光所標記。

圖中所示為海馬區每個神經元表達不同熒光。圖片來自Sanes實驗室。該技術由哈佛大學Jeff Lichtman和Sanes共同於2007年發明46。讀者如果感興趣，可以從Cell雜誌網站欣賞更多漂亮的Brainbow圖片（https://www.cell.com/pictureshow/brainbow）。

做任何研究，首先要建立好的研究方法。這實驗室第一篇Science的第二作者是實驗室助理教授、中國臺灣籍科學家郭智化（Jyh-Fa Kuo），現為埃默裡大學（Emory）榮譽退休教授。郭比較了多個物種（包括脊椎動物和無脊椎動物）不同組織，發現都存在著cAMP依賴的激酶酶活，並系統地研究了酶活條件、建立了靈敏的檢測酶活方法47。

用郭新建立的方法，Greengard等人還發現了更多的“第二信使”。郭透過比較不同的環腺苷酸，發現在龍蝦肌肉組織中cAMP（環腺苷酸）和cGMP（環鳥苷酸）各自啟用其特異性的下游激酶，證明cGMP和cAMP一樣可以作為細胞訊號的“第二信使”48。後來Greengard等人還發現了第三類“第二信使”，由鈣離子啟用的下游訊號，包括與鈣結合的calmodulin和其下游啟用的大腦特異性的CaMKII激酶49。

CaMKII在神經突觸可塑性、學習記憶中都有重要作用，後來和Greengard共享諾貝爾獎的Eric Kandel和麻省理工學院（MIT）由研究免疫轉而研究神經科學的日本科學家Susumu Tonegawa在這方面都有重要貢獻。CaMKII也是現在非常常用的神經元啟動子，在皮層錐體神經元、紋狀體的多棘投射神經元SPNs等特異性表達。

圖18. 神經細胞訊號通路及三個“第二信使”（cAMP，cGMP，鈣）（作者部分漢化）50。

對神經科學家而言，在體外試管裡做的生化反應沒什麼意思，有意思是在體內生理條件下發生的生化反應。對Greengard來說，當時最重要的工作就是去證明cAMP水平是否在生理條件下受神經活性調控，以及去尋找受神經遞質啟用的腺苷酸環化酶AC（類似於在代謝系統中由激素啟用的腺苷酸環化酶AC）。

這次，他要將生理學的方法和生物化學的方法相結合，從生理學的角度去研究活的放電的神經細胞發生的化學反應，從生化學的角度去研究化學反應在神經交流中的作用。1971年，Greengard發表了兩篇Science文章，分別回答了上面的兩個問題。

第一篇文章裡，Greengard等人先用生理學的方法分離了兔的頸上交感神經節（superior cervical ganglia，SCG），並對其做接近生理條件的刺激，然後用Brodie的方法提取cAMP，最後用郭之前建立的高靈敏度的方法檢測酶活，最終證明生理條件下的神經細胞活性確實能刺激cAMP合成及啟用下游激酶51。也就是說，神經活性誘導的細胞訊號通路和代謝系統激素誘導的訊號通路是一樣的。

那麼，它的機制是不是也是一樣的呢？神經活性是否也是透過啟用腺苷酸環化酶AC來刺激cAMP合成？在第二篇文章中，Greengard和他的學生John Kebabian重複兔頸上交感神經節刺激實驗，最終找到了受神經遞質多巴胺啟用的腺苷酸環化酶AC，提示頸上交感神經節中可能存在著釋放多巴胺的中間神經元，但最重要的是，他們首次發現多巴胺是透過提高cAMP水平來調控神經細胞活性52。這也是Greengard第一次涉足多巴胺研究。

如第二期文章介紹，在Carlsson、Hornykiewicz等人的努力下，當時的科學家們已經知道多巴胺是種獨立的神經遞質，其在紋狀體的釋放對運動調控至關重要，多巴胺缺失可導致帕金森症。但多巴胺是如何調控紋狀體細胞活性的卻未知。Greengard的發現提供了可能的機制，於是他開始研究紋狀體。次年（1972年），Greengard和Kebabian等人證實，在紋狀體中，多巴胺確實也能啟用AC-cAMP-激酶訊號通路53。

1976年，Van Rossum正式提出精神分裂症的“多巴胺理論”時，指出存在兩種多巴胺受體，當時的命名沿用去甲腎上腺素受體命名，分別為alpha和beta受體，alpha啟用神經細胞，beta不能。1979年，為避免混淆，Kebabian等人將其改為多巴胺一型和二型受體54。後來的研究陸續發現在其他組織及紋狀體中，多巴胺二型受體事實上不是不能啟用，而是抑制AC-cAMP-激酶訊號通路及紋狀體細胞活性。

現在我們知道，紋狀體多棘投射神經元（spiny projection neurons，SPNs）主要表達兩種多巴胺受體：一型D1Rs（含D1和D5兩個亞型）和二型D2Rs（含D2、D3、D4三個亞型）多巴胺受體。兩種多巴胺受體都是七重跨膜的G蛋白偶聯受體（G-protein-coupled receptors，GPCR），五重、三重跨膜等就目前所知是沒有功能的。G蛋白根據其alpha亞基不同主要有三種，和多巴胺受體相關的是Gs（s是stimulate，表示刺激、啟用）和Gi（i是inhibit，表示抑制）兩種。

一型受體D1Rs是Gs蛋白偶聯的受體，透過啟用腺苷酸環化酶AC，刺激cAMP訊號通路，提高細胞活性；二型受體D2Rs則剛好相反，是由Gi蛋白偶聯的受體，透過抑制腺苷酸環化酶AC而抑制cAMP訊號通路，抑制細胞活性（圖18）。

圖19. 多巴胺訊號通路簡圖。

可以看到長長的受體蛋白在細胞膜上來來回回跨進跨出共7次。當受體和多巴胺結合後，便會啟用下游Gs或Gi通路，分別啟用或抑制細胞活性（作者繪製）。

對生物學研究而言，最重要的永遠是功能、功能、功能（重要的事說三遍）。1971年發表的Science文章裡， Greengard等人透過對兔的頸上交感神經節的突觸前刺激，發現突觸後細胞cAMP水平升高了，直接證明cAMP水平在生理條件下受神經活性調控。那麼下一步自然是去證明是否cAMP水平變化能介導突觸後細胞的活性、調控生理學功能。

這次Greengard等人透過直接加入cAMP，或用藥理學的方法改變（提高或降低）cAMP水平來檢測其對神經活性的影響。次年（1972年），Greengard等人再發Science文章，發現頸上交感神經節的突觸前刺激可以在突觸後細胞先誘導一個快速反應的興奮性突觸電壓（EPSP），緊接著一個慢反應的抑制性電壓（slow-IPSP）；而透過調控cAMP水平，則可改變這個慢反應的突觸抑制性電壓（slow-IPSP），從而改變神經細胞活性55。1971和1972年的這兩篇Science文章足以證明cAMP介導由多巴胺等神經遞質引起的慢反應。

1972年，Greengard還和錢永佑（Richard Tsien）合作，用相同的方法，但是研究cAMP對心臟浦肯野纖維（cardiac Purkinje fibres）活性的影響56。這次的神經遞質不是多巴胺，而是腎上腺素。腎上腺素對浦肯野纖維動作電位的影響是首先去極化上升更高，其次電壓復極化下降更早；前者主要是由鈉和鈣離子參與的緩慢內向電流介導，後者由鉀離子外向電流介導。錢永佑是鈣離子通道的專家。與頸上交感神經節類似的，cAMP可模擬腎上腺素對浦肯野纖維動作電位的影響，擴大納／鈣離子緩慢內向電流和鉀離子外向電流，使動作電位去極化更強，復極化更早。

錢永佑

錢永佑是著名的神經科學家，錢學森之侄，錢永健（Roger Tsien）的大哥（錢永健因對熒光蛋白GFP的研究而獲2008年諾貝爾化學獎）。錢永佑在中國出生，兩歲隨父母移民美國。大學和碩士就讀於麻省理工MIT電子工程專業，碩士畢業後獲羅德獎學金（Rhodes Scholarship，最負盛名的國家獎學金之一）去牛津大學讀博士。博士期間和Hodgkin有過交流57。在牛津獲得博士學位後，錢永佑於1970年（晚Greengard兩年）在耶魯大學建立實驗室。錢永佑現為紐約大學神經科學和生理學系系主任。

圖20. 錢永佑（Richard Tsien）（圖片來源自紐約大學官網）

錢永佑培養了很多優秀的神經科學家，包括改進光遺傳技術並作出重要貢獻的Karl Deisseroth和Edward Boyden，上文提到的Raman的導師Bruce Bean，浙江大學胡海嵐、清華大學時松海和冷泉港李波等人的導師Roberto Malinow，膠質轉分化神經再生領域的陳功，還有年輕一輩如波士頓大學韓雪、北京大學李毓龍、浙江大學馬歡、中山大學李勃興等。

Greengard在1971年的兩篇文章用生理學的方法去刺激神經遞質傳遞，用生物化學的方法去檢測cAMP水平變化。1972年的兩篇文章則是用生物化學的方法去調控cAMP水平的變化，用生理學的方法檢測細胞活性的變化。將不同的方法透過不同的方式結合，換一個組織、換一個細胞、換一個藥物、換一個刺激強度，每一篇都是重量級的文章，似乎隨便怎麼做都是重要的發現，這或許從側面反映了一個新的領域的開啟。

從1969年發表第一篇Science到1978年，成立實驗室的第一個十年裡，Greengard發表了一百多篇文章，其中11篇Science，9篇Nature（其中第一篇為Nature New Biology，當時的Nature三大期刊之一，後來併入Nature，第一作者是錢永佑，就是上面提到的記錄心臟浦肯野纖維的文章）。

這十年的研究中，Greengard等人主要系統研究了不同物種的不同組織中cAMP和cGMP啟用的PKA和PKG激酶活性，對神經細胞活性的調控等。另外，磷酸化／去磷酸化的化學反應除了介導神經傳遞慢反應、調節突觸後細胞活性外，還能調控神經傳遞、影響突觸前神經遞質釋放。

Greengard等人發現PKA在大腦中的第一個底物，命名為Protein I（典型Greengard風格，簡潔明瞭），後來發現Protein I主要在突觸中（突觸前細胞的軸突末端“手指尖”），改名為Synapsin I。Synapsin I 在神經遞質的傳遞中有重要作用。神經遞質以“泡泡”形式儲存。在軸突末端其實有兩個“泡泡”庫，一個貼近膜的“隨時釋放庫”，神經細胞一放電就釋放神經遞質，一個遠離膜的“保留庫”，當“隨時釋放庫”不足的時候補給“泡泡”。Synapsin I被cAMP啟用的PKA激酶磷酸化是實現這個補給作用的關鍵一步。這一系列研究奠定了Greengard獲諾獎的基礎。

之後，大批的年輕人湧入Greengard的實驗室。接下來幾十年，Greengard的研究全面開花，幾乎在每一個方向都有深入的發展，包括PKA、PKG、和其他激酶，如CaMKII、及磷酸酶、Synapsin I和其它磷酸化/去磷酸化底物、多巴胺受體及其它神經遞質受體訊號通路。因多巴胺在精神分裂症、帕金森症、毒品成癮、多動症等疾病中的重要作用，多巴胺訊號通路也成了Greengard實驗室的一個研究重點，並最終發現了一個在紋狀體高度表達的、整合多巴胺和其他訊號的主調控因子DARPP-32 （dopamine and cyclic AMP regulated phosphoprotein MW=32 kDa，多巴胺和cAMP調控的32千道爾頓大小的磷酸化蛋白）。

這一系列的研究，毋庸置疑地證明了Greengard最初的想法是對的，神經傳遞的慢反應跟代謝系統激素介導的反應是一樣，透過第二信使、激酶／磷酸酶的磷酸化／去磷酸化級聯（cascades）反應來調控離子通道活性、神經遞質受體活性、基因表達等來最終實現對神經細胞活性的調控。這些便是他獲諾貝爾獎的主要貢獻。

圖21. 在紋狀體SPN神經細胞裡，多條訊號通路彙集在主調控因子DARPP-32，

透過磷酸化和去磷酸化調控DARPP-32活性及下游效應58。

未完待續……