RNA是植物分子生物學研究的重要物件之一, 從植物中獲得高質量的RNA是後續RT-PCR、Northern雜交、cDNA文庫構建等分子生物學研究的基礎。古人云：“合抱之木，生於毫末；九層之臺，起於累土；千里之行，始於足下。”因此，只有從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA 才能為後續的研究提供良好的開端。
無論是新手還是老司機，在植物RNA提取實驗中可能都遇到過或大或小的問題，這些問題不僅浪費額外的試劑和樣本，還會消耗我們大量的精力和心血去處理和分析資料，常常把我們弄得手足無措。別慌！諾唯贊帶領你擊破各個難點，掌握植物RNA提取的幾大法寶，成為大神指日可待！
植物RNA提取難點
1. RNA為單鏈結構且有2’-OH易發生化學反應，分子結構不穩定；
2. 一些植物組織中或富含酚類化合物或富含多糖或含有某些尚無法確定的次級代謝產物對提取產生干擾；
3. RNase的活性較高，遍佈各處，不易清除。
（a）核糖核苷酸結構（b）RNA單鏈結構；（c）多糖多酚結構
萬事開頭難，既然知道植物RNA提取的難點之後，接下來就跟著小編的腳步，一起去探索解決辦法吧！
植物RNA提取方法
1.Trizol法
利用提取液中異硫氰酸胍或苯酚的強變性氧化能力使細胞膜裂解、蛋白質變性，抑制內源RNase活性的發揮，同時使核酸釋放於水相之中，透過沉澱法回收RNA。
優點：操作簡單、RNA提取完整性好等優點，適用於一些次生代謝物含量少的植物組織。
缺點：多酚類物質在提取的過程中被氧化成棕褐色的醌類化合物，從而與核酸大分子不可逆結合，使用氯仿抽提去除多酚類物質的同時，造成RNA丟失[1]。
2.SDS-苯酚法
利用SDS和苯酚能夠使蛋白質變性、抑制內源RNase活性的發揮，裂解細胞膜，可以將溶液中蛋白質、多糖、DNA 分離至有機相中[2]，而RNA則留在上清之中。
優點：操作簡單，提取時間短。
缺點：在RNA提取過程中，產生較高含量的多酚類雜質，且所提取的植物總RNA無法進行反轉錄實驗。
3.試劑盒法
利用鹽酸胍裂解樣本，抑制RNase的活性；β-巰基乙醇變性蛋白，透過離心柱上的吸附膜，特異性吸附RNA。
優點：操作簡便、快速，安全、產物純度高，可隨時用於下游實驗。
缺點：多數需要手動操作，可能會濾膜堵塞，對RNA大小有要求。
知道了這些提取方法之後，大家可以根據自己的樣本型別和需求自由選擇最合適的提取方法喲！接下來還有乾貨等著你們呢！
產物質量檢測
濃度：產物濃度檢測常見的方法包括紫外分光光度計測量和Qubit儀器檢測；
PS：兩者都操作簡便，迅速，但無法區分降解核酸；紫外分光光度計測試成本低，易得到濃度虛高值。Qubit儀器測試成本高，價格較貴，但靈敏度較高。大家可以根據自己的需求選擇合適的方法檢測喲！
純度：紫外分光光度計進行測量
OD260/OD280=1.9-2.1說明純度很好；
OD260/OD280<1.9表明可能有蛋白質殘留；
OD260/OD280>2.1表明RNA可能存在部分降解或者殘留部分DNA，建議跑膠進行完整度檢測；
OD260/OD230<2.0表明可能存在鹽離子殘留。
如果大家使用紫外分光光度計測量後對提取的RNA純度把握不準，可以進行瓊脂糖凝膠進一步驗證是否存在蛋白、基因組或雜質殘留；
左圖箭頭代表蛋白殘留；右圖箭頭代表DNA殘留。
完整度：瓊脂糖凝膠電泳：1%瓊脂糖
（a）完整RNA；（b）部分降解RNA；（c）嚴重降解RNA。
2100儀器檢測：下游應用為qRT-PCR時，一般認為Rin≥5,說明RNA完整
不同樣本提取RNA後的2100檢測
注意的問題
植物RNA提取過程中應該注意的問題：
1.RNA降解
（1）選新鮮組織或細胞樣本，避免反覆凍融；組織離體後須迅速放入液氮中速存，後期轉移至-80℃長期儲存。
（2）未凍存樣本立即加入裂解液勻漿裂解，凍存組織加入液氮充分研磨；樣本投入量適當；無RNase操作。
（3）RNA分管儘快使用，電泳檢測用無酶水進行沖洗，電泳緩衝液用RNA無酶水配置，提高電壓並縮短跑膠時間。
2.RNA產量低
（1）樣本儲存不當或樣本儲存時間過久，或反覆凍融導致降解，事先了解好提取樣本中RNA含量水平，也可以採集新鮮樣本或經過液氮速凍後保存於-70℃。
（2）勻漿或者液氮研磨不充分，導致樣本沒有完全裂解，RNA釋放不充分。然而，並不是所有的樣本都對相同的裂解方案敏感。例如淋巴細胞、PBMCs 等和微生物細胞往往很難有效裂解，僅僅新增裂解緩衝液可能並不夠。為了提高裂解效果，可以將裂解緩衝液與機械裂解步驟（研磨珠破碎）匹配，或者在裂解液上游加入酶裂解步驟（如蛋白酶 K、溶菌酶等）。
（3）使用柱提法時，洗脫不充分，可以將RNase-free ddH2O滴加到純化柱膜中央，純化柱的洗脫體積為50-200 μL，若洗脫效果不理想，可以加入在55-70℃預熱的RNase-free ddH2O後，延長室溫放置時間，離心後進行第二次洗脫。
3.RNA出現基因組汙染
（1）柱提法：減少樣本起始投入量，DNaseI膜上消化。
（2）Trizol法：向裂解液中加入氯仿後，需要在低溫下高速離心；向裂解液中加入氯仿後，RNA分層，避免吸到中間層和下層。
參考文獻：
[1] 劉芳,官春雲.富含多酚類植物RNA提取的研究進展[J].作物研究,2015,29(01):91-95+100.
[2] Lewinsohn E , Steele C L , Croteau R . Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms[J]. Plant molecular biology reporter (USA), 1994, 12(1):20-25.
