文丨學術頭條，作者丨劉芳，編審丨HS
用一張晶片把你的面板組織瞬間變成血管或神經細胞，這聽起來實在是太過科幻。然而印第安納大學和俄亥俄大學的研究人員不但將其成了現實，還將晶片的製作技術全部開源。也就是說如果你掌握所需的醫學知識，在五到六天之內就能按照說明書製造出一款自己中意的 VIP 組織轉換晶片！
在這篇刊登於 Nature Protocols，名為 Fabrication and use of silicon hollow-needle arrays to achieve tissue nanotransfection in mouse tissue in vivo 的論文中，印第安納大學的科學家們詳細闡述了這種非侵入式且對人體無害的黑科技。利用電穿孔技術，你可以在毫秒內將質粒 DNA 直接匯入到小鼠（或自己）面板的特定深度，將面板轉染為血管或神經細胞。
nanotransfection 示意圖 | 來源：印第安納大學
作者稱，這種“組織奈米轉染技術”（tissue nanotransfection, TNT）所需要的裝置是可以標準化批次生產的。“組織奈米轉染技術”的最大優點是不需要用病毒作為載體，從而最大限度地降低了炎症反應和細胞死亡的風險。
發明這項技術的印第安納再生醫學和工程中心（Indiana Center For Regenerative Medicine And Engineering）主任 Chanda Sen 表示：“這篇論文將讓更多人一同參與到再生醫學中來。”
製備空心微針陣列
根據“奈米轉染”說明書，改變組織功能共分為三個步驟（共 25 個具體操作環節）：製備空心微針陣列、製備 TNT 器件，以及對細胞進行轉染。首先要考慮的是使用哪種微針陣列，各種不同形態的微針總有一款適合您。對於在區域性面板匯入質粒 DNA，作者建議使用尖端扁平的微針（見圖 1A）。對於深層組織的匯入，作者建議使用尖端鋒利的微針以促進組織穿透( 見圖 1B 或 1C)。
各種微針 | 來源：論文
選好款式以後我們就要進行手工製作了。
首先需要在雙面拋光的 4 英寸矽（Si100）晶片上覆蓋一層光刻膠，然後使用博世（Bosch）工藝對晶片進行深反應離子刻蝕（DRIE）。根據轉染需要可以製備三種不同的矽空心微針，包括頂端扁平的一型（圖 1E，Type I），頂端突出的二型（Type II）或帶有偏心孔的三型（Type III）（圖 1F，g)。後兩種尖端鋒利的微針陣列更有助於穿透到組織當中。
如果將針頭的奈米通道直徑縮小，那麼針頭輸出生物分子的速度也將相應增加；但是相應來說，這也可能限制透過針頭的分子總量。在奈米通道直徑過小（
此外，研究人員在在每個矽晶片上都連線了一個 Transwell，作為質粒 DNA 的儲存庫。
論文強調，要想做出高質量的微針陣列，必須特別注意兩個方面。第一個是在翻轉晶片以製造微針的奈米通道時需要精確對準（步驟 1A（Xix）），第二個是在製作的過程中要溫柔，以避免針孔中出現堵塞的現象（步驟 1A（xxii，xxvii 和 xxiv））。
TNT 器件的製備
在晶片製作好之後，需要將其和電穿孔裝置進行整合以實現質粒 DNA 的匯入。首先 TNT 晶片上安裝有一個儲液器，用來儲存有質粒 DNA 的溶液。為了實現奈米電穿孔，還需要一種精確控制的電脈衝發生器。研究人員用 PDMS 和固化劑混合，形成可嵌入晶片的 PDMS 薄膜。之後，晶片的正面、底面和 PDMS 膜的底面都用等粒子清洗機處理過，然後輕輕地壓在一起，在各層之間形成完整的粘合。PDMS 膜的厚度應調整為 2-4 毫米。
論文表示，大於 4 毫米的 PDMS 膜不夠靈活，不足以在晶片之間提供完全的防洩漏連線，而且還可能在連線過程中損壞晶片。而小於 2 毫米的 PDMS 膜又太柔軟，因此在晶片和薄膜之間會產生褶皺和氣隙。
小鼠實驗 | 來源：論文
使用 TNT 器件進行體內轉染
當利用電穿孔技術將 DNA 匯入到體內時，所施加的電壓決定了 DNA 分子上的遷移力有多大，從而決定了在恆定脈衝下匯入的距離有多遠。同時，電壓還決定了電穿孔過程中細胞膜上的孔密度和平均孔徑。中等電壓（100-150 V/mm）可以平衡匯入距離和孔隙引數。過高的電壓會破壞細胞和組織結構。在實驗中，研究人員使用了 8 到 12 周大的雄性小鼠。不過這並不代表活體小鼠實驗侷限於任何性別或年齡，任何小鼠都可以參與。
為了便於 TNT 晶片能接觸到面板更深層的細胞組織，實驗中的小鼠都被脫毛。之後電脈衝透過裝有質粒溶液的儲液器和微針達到面板。該電脈衝為方波，引數可調。以 200 V 電壓開始，穿孔脈衝電壓可以不斷增加以促進細胞膜孔隙的形成，之後再以 200 V 的驅動脈衝將質粒匯入組織。較高的電壓（>250 V）會增加驅動力，並在細胞膜上產生更大的孔隙，這有助於質粒的傳遞。但如果電壓太大的話就會對細胞產生毒性。
作者表示，這款帶有矽空心微針陣列的 TNT 晶片的最終目標是對組織進行重新程式設計。在這款晶片的幫助下，實驗小鼠避免了後肢的組織壞死，甚至移植到大腦的神經細胞還改善了中風小鼠的神經功能。
目前，科學家們還沒有在人類身上進行大規模的臨床試驗。但在製備奈米晶片的方法開源以後，想必會引來大批生物駭客的興趣。
屆時又會有怎樣神奇的發現，我們拭目以待。
參考文獻：https://www.nature.com/articles/s41596-021-00631-0
