Real-time qPCR實驗設計—從開始到結束

實驗設計其實比實驗本身更重要！！好的實驗設計可以事半功倍，節省時間節省時間！！尤其做生物實驗，一定要查詢儘可能完全的相關資料，整理好思路，設計好實驗路線。當然實驗過程中出現各種各樣的變化，但有足夠多的背景知識，就可以分析原因，才有可能創新。

一、 對於一個real-time qPCR而言，首先就是實驗材料的處理和料；然後引物設計，這步至關重要，好的引物是實驗本身成功的50%；進行實驗和資料分析（這一部分單獨說明）。

1. 實驗材料的處理和準備：
   在材料收集過程中，儘量避免RNA的降解（尤其對於絕對定量的樣品）。
2. 引物設計

一般real-time PCR 引物的設計遵循下面一些原則：

• 擴增產物長度在80-150bp。
• 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
• 產物不能形成二級結構。
• 產物長度一般在15～30鹼基之間。 G+C含量在40%～60%之間。 鹼基要隨機分佈。
• 引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
• 引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
• 引物5’端可以修飾。
• 引物3’端不可修飾。
• 引物3’端要避開密碼子的第3位。

  3.Taqman 探針的設計稍有不同，一般有公司設計合成。遵循下面以下原則：

• 儘量靠在上游引物；
• 長度30－45bp，Tm比引物高至少 5℃；
• 5’端不要是G，G會有淬滅作用，影響定量

二、Real-time qPCR操作過程操作過程

1. RNA提取和反轉錄：全程佩戴一次性手套。
2. Mix配製：一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。通常來講，反應體系的引物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1µl或者1µl的10倍稀釋液，要根據目的基因的表達丰度進行調整。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的資料分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。

3.儀器設定

所有儀器的操作都基本一致。設定的時候包括反應板設定（plate setup）和程式設定（program setup）。

A．首先是實驗目的選擇：定量還是其他。

1. 實驗方法的選擇: 如，比較Ct的SYBR Green方法，Fast程式，以cDNA為模板進行。
2. 目的基因的設定：有幾個目的基因和目的基因的名稱。
3. 樣品的設定: 包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設定和生物重複的設定
4. 對照組和內參基因的設定: 這個是為後面的定量做準備的
5. 反應程式的設定：PCR反應程式的設定要根據不同公司的MasterMix。迴圈反應是9X℃ X秒，X℃ X秒的X個迴圈。溶解曲線程式採用儀器預設設定就可以。或者是儀器說明書上建議的程式。
6. 反應體系的設定：

A-G這五個步驟這五個步驟簡單設定好，可以儲存，修改修改反應程式或者立刻進行反應。

4.設定好之後，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點選RUN ！

三、Real-time qPCR資料分析

1. 基線（baseline）

通常是3－15個迴圈的熒光訊號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設定基線

2.閾值（threshold)

自動設定是3-15個迴圈的熒光訊號的標準偏差的10倍

手動設定：置於指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光訊號明顯增強。

同一次反應中針對不同的基因可單獨設定閾值，但對於同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

3.Ct值 :與起始濃度的對數成線性關係。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

4.Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光

發射強度的比值。

5.Rn△：Rn△是Rn扣除基線後得到的標準化結果（△Rn = Rn–基線）。