本報記者田明 實習生梁楠
蘋果科技創新團隊是立足河南優勢特色園藝作物成立創新團隊，重點圍繞蘋果產業中存在的瓶頸問題，瞄準科研前沿，積極立項開展研究並取得可喜成績。近日，河南農業大學該團隊在生態環境領域國際著名期刊Journal of Hazardous Materials（中科院一區Top，IF=10.588）線上發表了題為A sensitive visual method for onsite detection of quarantine pathogenic bacteria from horticultural crops using an LbCas12a variant system的研究論文，這是繼蘋果病毒病田間視覺化檢測研究（Plant biotechnology journal；Jiao et al, 2021，中科院一區Top，IF=9.803）後的又一成果。該研究開發了一個新型CRISPR/LbCas12a突變體蛋白，它比現有商品化LbCas12a蛋白具有更強的活性和更廣泛的PAM序列適應性。藉助此突變體蛋白並整合一套生物資訊學分析流程，能夠方便快捷的設計病原微生物的檢測靶標位點，實現對檢疫性病原物（蘋果火疫病、西瓜細菌果斑病病原菌等）的田間視覺化快速檢測。
LbCas12a在分子診斷方面也有很大的應用前景，透過識別特定的dsDNA序列對ssDNA進行非特異性切割，特別適合於檢測病毒和病原菌。雖然現有的基於Cas12a的核酸檢測已經成為一種靈敏（aM級）特異的診斷方法，但仍需進一步完善。所需改進之一就是LbCas12a蛋白更傾向於識別基因組中頻率較低的5’-TTTV-3’ PAM（V表示A/G/C），這會阻礙crRNA靶標位點的設計，使得靶標位點選擇過少。
該研究將5個突變（D156R、G532R、K538V、Y542R和K595R）同時匯入LbCas12a蛋白從而產生相應的LbCas12a變體，稱為LbCas12a-5M（圖1A-B）。熒光檢測顯示，這些氨基酸突變可以在一定程度上顯著提高其對 TTTV PAM靶標的活性，並識別非常規TNTN PAM，保留更強大的反式切割活性；透過Michaelis-Menten動力學分析，LbCas12a-5M的催化效率（以Kcat/Km值表示）是LbCas12a-wt的1.2倍和2.5倍，表明LbCas12a-5M突變體比野生型蛋白活性更強，PAM適應性更廣，更適合應用於核酸檢測。
圖2 特異性檢測位點設計與靈敏度分析
藉助宏基因組分析軟體Metaphlan v 3.0，整合並開發了一套針對於細菌微生物的crRNA靶標設計流程。結合LbCas12a-5M視覺化檢測系統，可以不借助試驗儀器，在田間30min之內，快速視覺化檢測蘋果火疫病病原菌E. amylovora和西瓜細菌果斑病病原菌A. citrulli，靈敏度可以與qPCR媲美。該研究工作有助於更好地理解如何構思、建立和應用基於CRISPR/Cas12a系統的、穩定快速的診斷方法以用於病原菌檢疫，適用於包括植物、動物、人類致病細菌以及土壤和環境中存在的有益或有害細菌在內的任何何細菌微生物的檢測，這將有助於阻止細菌性疾病的傳播和爆發。
河南農業大學青年英才焦健博士為該論文第一作者，馮建燦教授和鄭先波教授為共同通訊作者，河南農業大學為第一單位及第一通訊作者單位，中國農業科學院鄭州果樹研究所劉崇懷研究員為合作作者參與了本項研究工作。該研究工作得到了國家自然基金（31801818）、河南省科技攻關專案（212102110113）和河南農業大學青年英才專案（30500631）以及河南省重大公益科技專項（No. 201300110500）的資助。
原文連結：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.128038
（編輯：田明）
