成體骨骼肌幹細胞（muscle stem cell）也被稱為衛星細胞（satellite cell，SC），在骨骼肌損傷修復中起關鍵作用。通常情況下， SC前體細胞形成於出生前兩天左右的小鼠胚胎中，它們在小鼠出生後不斷增殖分化形成肌肉，這一生長時期被稱為幼年肌肉生長期（postnatal myogenesis）【1】，這些活躍增殖狀態的細胞也被稱為幼年期SC（juvenile SC）。在小鼠出生後2-4周，這些細胞的增殖結束，迴歸靜息狀態成為成年小鼠的備用幹細胞（Quiescent SC， QSC）。在健康的成年小鼠骨骼肌中，這些QSC位於基底膜下，特異性表達Pax7轉錄因子，但是當肌肉受到損傷刺激後，會誘導表達肌肉特異性轉錄因子MYF5和MYOD1，快速啟用並進入細胞週期。這些啟用的SC（activated SC，ASC）也被稱為成肌細胞 (myoblast)。其後，成肌細胞大量增殖，降低Pax7的表達進一步分化融合形成新的肌纖維。同時，部分成肌細胞會維持Pax7的表達並返回到靜息轉態以維持SC數量【2】。
近年來，CRISPR/Cas9已被廣泛用於各種小鼠模型的構建以及治療各種遺傳疾病【3】。在肌肉系統中，透過腺相關病毒 (adeno-associated virus，AAV)介導的遞送，CRISPR/Cas9已被成功用於治療杜氏肌營養不良症（Duchenne muscular dystrophy ，DMD)。鑑於AAV有限的轉載能力（＜4.7 kb），通常情況下Cas9和sgRNA需要被裝載到不同的AAV載體中，因此只有同時接收到二者的細胞核才能被編輯，這也直接限制了編輯的效率。另一方面，這些編輯多是發生在肌纖維中，而SC尤其是QSC能否被CRISPR/Cas9編輯有待進一步的研究。
2021年9月16日，香港中文大學王華婷研究組與孫昊研究組在Stem Cell Reports上聯合發表題為CRISPR/Cas9/AAV9-mediated in vivo editing identifies MYC regulation of 3D genome in skeletal muscle stem cell的研究論文。該文構建了一個能夠對SC進行體內編輯的系統，並利用該體系揭示轉錄因子MYC可透過影響三維基因組調控SC的啟用。
首先，為了便於在體內編輯SC，研究人員構建了可在SC中表達Cas9的小鼠（Pax7Cas9）。Cas9的表達並未對SC的數目、肌纖維的大小以及骨骼肌的損傷修復產生明顯的影響。接下來，研究人員在處於活躍狀態的juvenile SC中驗證CRISPR/Cas9的編輯效果。為此，研究人員選擇Myod1作為範例，利用AAV9將sgRNA透過肌肉注射的方式遞送到出生10天（postnatal 10，P10）的Pax7Cas9小鼠中。在注射4周後，分選出的SC中MYOD1的蛋白水平顯著降低，當AAV9-sgRNA的劑量高於1×1011 vg時，Western已檢測不到MYOD1蛋白表達。進一步的測序發現，編輯效率最高可達95.08%。研究人員又進一步測試了雙sgRNA的編輯效果，在相同劑量下，雙sgRNA的編輯效率要略高於單個sgRNA。這些充分證明CRISPR/Cas9可以高效編輯juvenile SC。
其後，研究人員進一步驗證CRISPR/Cas9是否能夠編輯處於靜息狀態的QSC。為此，他們構建了可在SC中誘導表達Cas9的Pax7ER-Cas9小鼠。相較於Pax7Cas9小鼠，在Pax7ER-Cas9小鼠中Cas9的表達可透過他莫昔芬（Tamoxifen，Tmx）控制，從而將CRISPR/Cas9編輯限制在QSC中。研究人員採取了3種不同的策略，但遺憾的是均未能有效編輯QSC。
接下來，研究人員進一步將該系統用於編輯其他SC中的關鍵轉錄因子（key transcription factor，key TF），以探究它們在SC中的功能。已有的研究證明【4】，關鍵轉錄因子的表達受到超級增強子（super enhancer，SE）的調控，而關鍵轉錄因子又可結合到超級增強子上調控其功能。利用這一特性，研究人員首先在SC中分別預測了一系列可能調控SC靜息以及啟用的關鍵轉錄因子。作為其中一個因子，Myc被編輯後，其蛋白水平明顯降低，編輯效率高達83%。功能上，Myc編輯導致SC的啟用顯著降低，而骨骼肌損傷修復也被顯著抑制。最後，研究人員又進一步探討了MYC調控SC啟用的潛在機制。透過Hi-C，研究人員發現Myc編輯導致三維基因組明顯改變，同時伴隨著基因表達水平的改變，暗示MYC可能透過調控三維基因組進而調控基因表達，從而影響SC的啟用。
總而言之，這項研究首次揭示了CRISPR/Cas9/AAV9-sgRNA系統可以高效編輯處於活躍狀態的juvenile SC，但不能編輯處於靜息轉態的QSC。該系統可用於編輯研究SC中調控因子的功能。相較於傳統的構建基因工程小鼠的方法，該系統大大降低了體內敲除特定基因所需要的時間和精力，尤其是需要同時敲除多個基因時，該系統更具優勢。另外，不僅僅是編碼基因，該系統也可用於非編碼基因功能的研究。
香港中文大學化學病理系博士後何良強，博士生丁英哲，矯形外科與創傷學系博士後趙喻（現為中山大學副教授）是該研究成果的共同第一作者。矯形外科與創傷學系王華婷教授與化學病理系孫昊教授是該論文的共同通訊作者。
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