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減少和控制產物相關雜質是雙特異性抗體純化工藝開發過程中的主要挑戰。目標產物變體（例如聚體和片段）去除的困難源於它們性質的相似性，相近的等電點、小的表面電荷差異和對不同鹽鹽和pH條件的疏水性。因此，許多雙特異性抗體純化過程需要多個步驟來減少雜質。這裡研究了三種疏水相互作用層析（HIC）填料（POROS Ethyl，Benzyl和Benzyl-Ultra），用於去除基於大腸桿菌的表達系統（XpressCF+）中產生的雙特異性抗體的聚集體。進一步研究了POROS苯甲基疏水填料的最佳工藝引數。
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研究目標
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- 對系列填料在雙抗在聚體去除效果上的對比，包括結合洗脫模式及流穿模式。
- 評估POROS 疏水填料在聚體去除上的效果和雙抗單體回收率。
- 研究POROS Benzyl 在放大規模上對於聚集體去除的動態載量。
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物料與耗材
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雙特異性抗體：大腸桿菌無細胞系統 (XpressCF+)表達的bsAb1
耗材：
- 低疏水性和高疏水性HIC PreDictor 96孔板
- POROS Ethyl, Benzyl和Benzyl Ultra 1mL預裝柱
- 層析柱: Tricorn, HiScale, and AxiChrom
裝置和軟體
- AKTA Avant 25, 150和 Pilot 系統
- Unicorn 7.3
- UHPLC 1290 Infinity II System
- Chromeleon 7.2
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方 法
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圖1 全部篩選的疏水填料的疏水性大小排序
圖2 開發bsAb1純化工藝的疏水填料從篩選到最佳化的7大主要步驟流程圖
篩選瓊脂糖基架疏水填料
- 結合洗脫模式和流穿模式篩選的12種瓊脂糖基架疏水填料
- 在 PreDictor 板和1mL 柱子上測試
圖3 疏水填料篩選每步收率圖
- 高鹽條件在結合洗脫模式下容易形成bsAb1沉澱
- 流穿模式下收率低且bsAb1形成的聚體去除效果有限
POROS 疏水填料篩選
圖 4. UPLC-SEC 分析上POROS填料上樣流穿液表1 三種疏水填料在聚體去除上的對比
- POROS Ethyl（疏水性最弱的填料）POROS Benzyl 和Benzyl Ultra（疏水性最強的填料）透過上Protein A純化的料液 到15cm高的疏水柱上來測試。
- 聚體去除效果排名為 Benzyl-Ultra > Benzyl > Ethyl， 收率則剛好相反。
- POROS Benzyl 在bsAb1聚體去除效果和收率上表現非常出色。
POROS Benzyl最佳化
測試條件：
- 鹽種類 (NaCl , Na2SO4 etc.)
- 鹽濃度 (10 –200 mM)
- 保留時間(2 –4 min, 透過柱子長度和流速計算)
- 上樣量 (10 –250 g/L resin)
- 不同批次規模 (0.2 L to 200 L)
圖5 POROS Benzyl 兩種規模下流穿模式重疊圖譜
注：Strip1 with water, strip2 with 1M acetic acid, CIP with 1M NaOH
表二 POROS Benzyl 在放大180倍後的聚體去除一致性
高載量下聚體去除
- 15-20% 聚體去除維持
- 75-85% bsAb1 單體回收率
實驗條件：
- 線速度: 400 cm/hr;
- 層析柱規格: 0.5 cm (D) x 15 cm (L)
- 保留時間: 3 min;
- 最大上樣量: 200g/L。
方框內的上樣載量可以使高聚體去除15-20% ，單體回收率在 75-85%之間。
圖6 雙抗聚體在POROS Benzyl填料FT模式下的流穿
bsAb1 雙抗聚體在疏水填料上的去除機理
圖7 疏水填料去除雙抗聚體機理示意圖
圖7 第一根柱子可以看出：
在柱子上的結合力：單體 和 片段< 聚體
在柱子中的流動性：單體 和 片段 > 聚體
從第二根柱子可以看出：
聚體把結合在柱子上的單體置換出來。
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總 結
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1、文章顯示POROS 填料在最佳化好的條件下可以在維持高單體回收率的同時具有去除聚體的優越能力。
2、POROS Benzyl 流穿模式可以去除 >10-20% 聚體（取決於上樣量），可以很好的作為中間層析步驟。
3、研究結果表明，在有效分離雙特異性抗體和其聚集體的過程中，聚集體的去除可以透過流穿模式取代吸附洗脫模式。
4、聚體去除能力在高上樣量下具有很高的一致性。
