孤雌生殖
2006年，Nature雜誌發表的一篇文章轟動了學術界，這篇文章證實科莫多巨蜥可以透過孤雌生殖（Parthenogenesis）繁衍後代，動物園僅有的兩隻雌性科莫多巨蜥在長期未接觸雄性科莫多巨蜥的情況下，生了蛋並孵化出了小寶寶，基因檢測顯示小寶寶的基因完全來自於它們的母親 (Watts et al., 2006)。
恐怖的科莫多巨蜥
恐怖的科莫多巨蜥
圖1 科莫多巨蜥以及透過孤雌生殖出生的小巨蜥。科莫多巨蜥是世界上最大的蜥蜴，體長可達3米，體重可達70千克。在此之前發現了七十多種可以進行孤雌生殖的脊椎動物但大部分體型較小。2006年，英國倫敦動物園的Sungai和切斯特動物園的Flora被報道透過孤雌生殖的方式產下了小巨蜥，小巨蜥全部為雄性，這與科莫多巨蜥的ZW性別決定機制有關，同時，小巨蜥是正常的二倍體生物噢。
孤雌生殖：指雌性配子可以在沒有雄性配子的情況下單獨發育成胚胎，它是無性繁殖的一種自然形式，是生物的一種生殖策略。它發生在一些植物、無脊椎動物（例如輪蟲、線蟲、水蚤、蚜蟲、蟎蟲、螞蟻、蜜蜂等）和脊椎動物（例如魚、兩棲動物、爬行動物、鳥等）中。
圖2 有性生殖和孤雌生殖的過程。有性生殖（紅色部分）是由卵母細胞和精母細胞分別形成配子，結合後形成受精卵，再由受精卵發育成為新個體的生殖方式。而孤雌生殖沒有形成受精卵這一步，它分為單倍體孤雌生殖（紫色部分）、自體融合生殖（橙色部分）和無融合生殖（黃色部分）這幾種型別。圖片來源：Britannica。
那麼有哪些孤雌生殖的方式呢？
（1）一些生物的卵母細胞透過減數分裂形成配子，配子直接發育成個體，這種方式稱之為單倍體孤雌生殖（Haploid parthenogenesis）（圖2）。典型例子為蜜蜂群中蜂后的生產方式，蜂后產的未受精卵發育成雄蜂，雄蜂即為單倍體配子發育而成；蜂后產的受精卵發育成工蜂，為有性生殖。
（2）在開篇科莫多巨蜥的例子中，雌性科莫多巨蜥的卵子與它的一個“姐妹”——極體融合，這種雌性配子之間自行融合併發育出胚胎的孤雌生殖被稱為自體融合生殖（Automixis）（圖2）。
注：卵母細胞經過兩次減數分裂會形成一個卵細胞和2-3個極體，極體一般會自行凋亡，但在特殊情況下，會存活下來。
（3）一些生物的卵母細胞不透過減數分裂形成配子，而是透過有絲分裂形成配子，那麼配子生來就是二倍體，並由此發育出個體，這種生殖方式叫無融合生殖（Apomixis）（圖2）。這種生殖方式也將是伯小遠本文將重點和大家分享的。
圖3 有絲分裂（mitosis）和減數分裂（meiosis）過程圖。圖片來源：http://bio1151b.nicerweb.net。有絲分裂經一次分裂，一個母細胞形成兩個與母細胞完全相同的二倍體子細胞；減數分裂則經過兩次分裂，一個母細胞形成四個與母細胞完全不同的單倍體性細胞。
雜種優勢
雜種優勢（Heterosis）是指兩個遺傳組成不同的親本（物種、亞種、品種或自交系）雜交，產生的雜種F1代在生長勢、繁殖力、抗逆性、產量及品質等方面比其雙親表現優越的現象。幾乎所有一年生作物都在一定程度上表現出雜種優勢。
圖4 玉米不同表型性狀雜種優勢的表現 (Hochholdinger & Baldauf, 2018)。雜種優勢的表型體現在（A）玉米幼苗根的性狀、（B）株高和（C）穗軸大小。
在生產上可利用這個特點進行生產，但一般只能利用F1代，F2代由於基因重組導致性狀分離，在生產上無法繼續使用。因此，每年都必須製備具有雜種優勢的F1代種子供生產使用。
那麼，如何進行雜種一代制種呢？目前有以下幾種方法：
01人工去雄生產雜交種子
如菸草、番茄。難度大，成本較高。
02利用化學藥劑殺雄
不同植株的生殖器官發育並非完全同步，加之氣候因素造成的不確定性均會對化學殺雄效果產生影響。
03利用自交不親和系
如大白菜、甘藍等多采用這種方法。品種（或品系）有正常的雌蕊和雄蕊，但自交和兄妹交（兄妹交是指品種或品系不同植株間授粉）均基本不結實的育種材料，就是自交不親和系。以這種品系做母本，以普通品種做父本，間行種植，收穫的就是雜種一代種子。
04利用雄性不育系
如高粱、水稻。利用雄性器官退化或異常但雌性器官發育正常的株系免去人工去雄的麻煩，下面將進行介紹。
大家聽的最多的可能是利用雄性不育系（“三系法”）生產雜交水稻的方法，該體系的發明人是“雜交水稻之父”——袁隆平院士。水稻是典型的自花授粉植物，雌雄同花（圖5），水稻的雜種優勢可以利用雄性不育株系，透過異花授粉的方式來生產雜種一代種子。
圖5 水稻花的結構。
“三系”是指雄性不育系（A）、雄性不育保持系（B）和雄性不育恢復系（R）（圖6）。“三系法”是指保持系與不育系雜交，獲得不育系種子供來年制種和繁殖用；不育系和恢復系雜交，獲得雜交種子；保持系與恢復系的自交種子則繼續作為保持系和恢復系使用。
1973年，石明松先生髮現了光敏不育系農墾58S，它是由核基因控制的雄性不育系，育性轉換受光溫條件影響，既可以自身繁種，又可以作為不育系用於制種。後來在袁隆平院士的主持下，“兩系法”雜交水稻研究成功並投入應用。
圖6 三系法（a）和兩系法（b）雜交水稻工藝對比圖 (He, 2020)。
無融合生殖
1987年，袁隆平院士在《雜交水稻》雜誌上發表了《雜交水稻的育種戰略設想》一文，提出了雜交水稻的育種可以分為三系法、兩系法和一系法三個戰略發展階段，朝著程式上由繁到簡且效率越來越高的方向發展。三系法和兩系法，伯小遠已經介紹過了，那袁爺爺說的一系法是什麼呢？其實一系法指的就是利用無融合生殖技術固定雜種優勢的育種方法。早在上世紀30年代，國外科學家們就提出了利用無融合生殖的方式固定雜種優勢的設想。但經過多國科學家近一個世紀的攻關，仍然未研究清楚其分子機制，也未能按設想那般將該技術應用於作物育種中。但最近十幾年的研究成果，正在使這種困境逐漸好轉。
AMAZING 驚！減數分裂逆轉為有絲分裂！
按照我們在前文“孤雌生殖”部分所述——“一些生物的卵母細胞不透過減數分裂形成配子，而是透過有絲分裂形成配子，那麼配子生來就是二倍體，並由此發育出個體，這種生殖方式叫無融合生殖”，那麼在植物中，如果我們想透過無融合生殖技術來進行雜種一代制種，那麼，我們需要讓植物的母細胞繞過正常的減數分裂和雙受精（圖7）過程，繞過孟德爾和摩爾根提出的遺傳學三大定律，才有實現的可能。也就是說，想要得到和母本一模一樣的克隆種子，目前的重點在於如何將母細胞的減數分裂過程轉變為有絲分裂？
圖7 植物減數分裂和雙受精過程。圖片來源：Adobe Stock。
2009年，法國國家農業研究院Raphaël Mercier團隊在Plos biology雜誌上發表了題為“Turning meiosis into mitosis”的文章 (d'Erfurth et al., 2009)，該團隊創造性地開發出了一種擁有MiMe基因型的擬南芥，其母細胞的減數分裂被有絲分裂完全取代，因此可產生二倍體配子（圖8），該研究是工程化無融合生殖技術的重要一步。
圖8 該文主要結果的示意圖 (d'Erfurth et al., 2009)。第一次減數分裂時，同源染色體重組並分離，第二次減數分裂過程更類似於有絲分裂，最終姐妹染色單體均勻分離。在osd1突變體中，第二次減數分裂被跳過，因而產生了具有重組遺傳資訊的二倍體配子。Atspo11-1/Atrec8雙突變體經歷類似有絲分裂的分裂，而不是正常的第一次減數分裂，之後是不均勻的第二次減數分裂，而這種不平衡的染色體分離最終導致不育。在osd1/Atspo11-1/Atrec8三突變體（MiMe基因型）中，Atspo11-1/Atrec8突變的存在導致類似有絲分裂的第一次減數分裂發生，而osd1突變的存在阻止了第二次減數分裂的發生，至此，減數分裂被有絲分裂取代。因此，擁有MiMe基因型的植株，其配子在基因上與母細胞相同。MiMe（mitosis instead of meiosis）指有絲分裂代替減數分裂。
在osd1/Atspo11-1/Atrec8三突變體（MiMe基因型）中，母細胞的減數分裂終於如期望般地被有絲分裂取代了，看起來離實現無融合生殖似乎很近了，但問題又來了，由於母細胞不再進行減數分裂，那MiMe的子代豈不是每繁殖一代就會增加一倍的染色體數量？事實也確實如此（圖9）。
圖9 MiMe株系的每一代都會倍性加倍 (d'Erfurth et al., 2009)。在隨後的的幾代中，MiMe的倍性在每一代翻倍，從（A）2n（10條染色體）到（B）4n（20條染色體）到（C）8n（40條染色體），左側顯示有絲分裂中期，右側顯示相應的4周齡植物和花朵。
綜上，想要實現無融合生殖，已經成功了第一步，即讓母細胞進行有絲分裂而非減數分裂，那麼接下來，還需要進行第二步。
AMAZING驚！讓有絲分裂剎車！
2011年，Raphaël Mercier團隊再接再厲，與Imran Siddiqi團隊和Simon W L Chan團隊合作，在Science雜誌上發表了題為“Synthetic clonal reproduction through seeds”的文章 (Marimuthu et al., 2011)，他們將上文中提到的MiMe株系的子代與GEM株系雜交，得到了與母本相同的克隆種子（圖10B、C）。
伯小遠猜想，Raphaël Mercier團隊大概是受2010年發表的Nature文章“Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination”的啟發，這篇文章在“純系養成——單倍體誘導技術（二）”中有詳細解讀，重點在於一個有關CENH3（著絲粒組蛋白3）的材料可以作為單倍體誘導系，而這可能可以阻止MiMe株系的每一代都會倍性加倍的特性。
GEM株系是指將兩種經修飾的CENH3共轉擬南芥cenh3-1胚致死突變體，可恢復植株的野生表型，將其作為父本，與母本MiMe株系雜交，後代中來自父本的染色體會消亡，結果顯示後代中34%（53/155）的個體為二倍體，而98%的二倍體子代僅含來自母本的染色體。
圖10 該文主要結果的示意圖 (Marimuthu et al., 2011)。（A）在天然的無融合生殖過程中，種子未受精即可發育。為了從有性植物中誘導克隆種子，該團隊使用了一個經雜交後子代的部分染色體會消亡的材料GEM；（B、C）將MiMe或dyad突變體與GEM雜交後，對子代基因型的檢測。
雖然該研究還未達到僅透過自交即可獲得克隆種子的預想，但該研究為在作物中實現無融合生殖的路徑提供了一種重要思路。研究到這裡，那麼接下來要解決如何透過自交獲得克隆種子的問題！
2019年，中國農科院王克劍團隊和Raphaël Mercier團隊在Nature Biotechnology雜誌上發表了題為“Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes”的文章 (Wang et al., 2019)，該研究將雜交水稻中三個減數分裂關鍵基因REC8、PAIR1及OSD1和參與受精的MTL基因共四個內源基因進行基因編輯，得到了Fix基因型植株，自交後其後代中存在二倍體子代，實現了雜種一代雜種優勢的固定，無需額外的雜交就可以直接獲得克隆種子。
注：關於水稻REC8、PAIR1及OSD1基因的相關背景知識可參考Raphaël Mercier團隊的論文 (Mieulet et al., 2016)；關於水稻MTL基因的相關背景知識可參考文章“純系養成——單倍體誘導技術（一）”。
圖11 在雜交水稻CY84中進行多重基因編輯固定水稻雜種優勢 (Wang et al., 2019)。（a）固定雜種優勢的理論模型；（b）同時靶向REC8、PAIR1及OSD1和MTL的CRISPR/Cas9載體；（c）比較在田中生長的CY84和Fix（osd1 pair1 rec8 mtl）的植物形態，Fix的結實率較低（4.5%），敗育的種子用白色箭頭表示，正常發育的種子用紅色箭頭表示；（d）用流式細胞儀對Fix的後代進行倍性分析，其後代包括四倍體和二倍體；（e）Fix的四倍體和二倍體後代及Fix克隆子代的後代的全基因組測序；（f）比較在田中生長的CY84和Fix克隆子代的植物形態，敗育的種子用白色箭頭表示，正常發育的種子用紅色箭頭表示。
該研究基於前期的研究成果，透過敲除四個基因創制Fix材料以獲得克隆種子：敲除三個與減數分裂有關的基因REC8、PAIR1及OSD1，將雜交水稻CY84母細胞的減數分裂轉變為有絲分裂，同時，敲除與受精有關的MTL基因使其後代倍性不變。首次實現了雜交水稻一系法的理論驗證。可以預見，無融合生殖的下一步將是解決結實率低以及後代中二倍體佔比低（6%=9/145）的問題。
AMAZING 驚！還有其他實現路徑！
2019年，Venkatesan Sundaresan團隊在Nature雜誌上發表了題為“A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds”的文章 (Khanday et al., 2019)，研究表明，在卵細胞中異位表達BBM1就足以誘導孤雌生殖；在MiMe材料中表達BBM1基因可以誘導產生克隆種子。這說明在有性繁殖植物中可以透過基因設計來實現無性繁殖，並可將這種方法擴充套件到大多數穀類作物中。
圖12 水稻無性繁殖 (Khanday et al., 2019)。（a）使用CRISPR/Cas9載體創制MiMe材料；過表達BBM1基因創制BBM1-ee材料；（b）流式細胞儀檢測MiMe材料T1子代的4n倍性；（c）左側：MiMe T0二倍體子代，中間：MiMe T1四倍體子代，右側：S-Apo材料（MiMe與BBM1-ee的子代）；（d）野生型材料和S-Apo材料的花葯；（e）野生型材料、二倍體子代、四倍體子代的稻穗比較；（f、g）各材料的種子大小比較。
小遠叨叨
在本文中，伯小遠給大家介紹了孤雌生殖、雜種優勢，還帶大家複習了有絲分裂、減數分裂、雙受精等基礎知識，最後給大家分享了在植物無融合生殖方向重要的研究成果。
大家可以看到，想在一個領域取得好的成果，需要創新且專注，每一個成果都是在前期研究的基礎上不斷迭代更新。把一個複雜的問題層層拆解，一個一個、一點一點地來進行解決，同時關注與研究領域相關的最新成果，大膽合作，再利用合適的研究工具，相信最後的結果一定會如願以償！
最後，伯小遠也希望大家一起努力，做一粒好種子！早日實現袁爺爺心心念唸的一系法雜交水稻的生產！
References：
Qiang He, Huafeng Deng, Pingyong Sun, Wuhan Zhang, Fu Shu, Junjie Xing, Zhirong Peng, 2020. Hybrid Rice. Engineering 6, 967-973.
D'erfurth I, Jolivet S, Froger N, Catrice O, Novatchkova M, Mercier R, 2009. Turning meiosis into mitosis. PLoS Biol 7, e1000124.
Hochholdinger F, Baldauf JA, 2018. Heterosis in plants. Curr Biol 28, R1089-R92.
Khanday I, Skinner D, Yang B, Mercier R, Sundaresan V, 2019. A male-expressed rice embryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds. Nature 565, 91-5.
Marimuthu MP, Jolivet S, Ravi M, et al., 2011. Synthetic clonal reproduction through seeds. Science 331, 876.
Mieulet D, Jolivet S, Rivard M, et al., 2016. Turning rice meiosis into mitosis. Cell Res 26, 1242-54.
Wang C, Liu Q, Shen Y, et al., 2019. Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes. Nat Biotechnol 37, 283-6.
Watts PC, Buley KR, Sanderson S, Boardman W, Ciofi C, Gibson R, 2006. Parthenogenesis in Komodo dragons. Nature 444, 1021-2.
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