Late-Breaking Abstract講者深度剖析基因突變在疾病發展中的作用，以及預後預測中的價值！
2021年12月11日-12月14日，第63屆美國血液學協會（American Society of Hematology，ASH）年會在美國亞特蘭大召開。在這項備受期待的會議上，委員會遴選了六項Late-Breaking Abstract（LBA），這六項千挑百選而來的研究只能在ASH 2021年年會上聽到！
在這六項研究中，兩項是血液學領域的基礎研究。LBA-2探索了克隆性造血在人類衰老和惡性血液疾病中的作用，指出克隆性造血的擴增速度越快，相應的惡變風險就越高！LBA-4則綜合運用了生物資訊學和臨床佇列資訊確認了兒童青少年中的全新急性髓系白血病（AML）亞型，有助於指導患兒的風險分層。
現在，就讓我們共同聆聽血液學最前沿的聲音！
LBA-2：不同突變帶來克隆性造血速度不同，擴增速度越快，惡性風險越高
人類細胞在整個生命過程中都會發生體細胞突變，其中部分突變可以驅動克隆擴增。這種現象在健康人的造血過程中很常見，被稱為克隆性造血（CH）。雖然克隆性造血被認為與多發性骨髓瘤和其他非血液疾病的發病風險增加有關，但目前人們對於這一現象發生發展過程的瞭解仍然有限，也不清楚控制這一過程的相關因素及其與衰老和惡性疾病之間的關係。
在ASH 2021大會上，Margarete A Fabre博士就介紹了一項描述克隆性造血過程及其在衰老和惡性疾病中作用的研究。
圖1.1 Margarete A Fabre博士介紹了最新進展
圖1.2克隆性造血與衰老和惡性疾病中作用的值得探索
圖1.3研究首先分析了來自385名老年人的血液樣本
這項由英國劍橋大學領銜的研究首先分析了來自385名老年人的1593份血液DNA樣本，每名參與者在大約13年內最多采樣5次。研究使用了深度靶向測序來識別和跟蹤697個克隆性造血並構建了邏輯迴歸模型。結果發現，92.4%的克隆老年期間呈現穩定的指數擴增。人們能準確地預測其擴增速度，實際與預測的克隆平均絕對誤差僅為3.5%。
圖1.4隨著年齡增長，能檢測到的克隆數量增多
圖1.5絕大多數克隆在老年人中穩定擴增
圖1.6克隆不同，擴增速度存在差異
各種不同的克隆突變驅動的增長率差異很大，DNMT3A和TP53突變驅動的平均年增長率最慢，大約僅為每年5%，而其他常見的驅動基因則帶來每年大約10%的擴增速度，包括TET2、ASXL1、PPM1D和SF3B1突變。
而SRSF2-P95H突變驅動的擴增速度最快，超過每年50%。大多數熱點突變並不會比其他突變帶來更快的擴增速度，同樣突變不同克隆的年增長速度差異不足5%，其對於擴增較慢的影響比較顯著。
圖1.7研究進一步探索了人一生中克隆性造血的變化
圖1.8克隆性造血擴增速度在不同年齡存在差異
為了分析人一生中克隆性造血的變化過程，研究人員透過目前在老年人中觀察到的擴增速度逆推了克隆性造血發生的時間。結果發現，不少克隆性造血在參與者出生之前就已經開始。
這顯然是不可能的，合理的解釋則是克隆性造血在人年輕時的擴增速度比在老年時更快。針對DNMT3A突變，人在年輕時候帶來的克隆擴增速度可能比老年時快得多，年輕時的速度至少是老年時的2倍。而TET2 突變在機體年輕時和老年時的克隆擴增速度可能差不多。
圖1.9研究深入研究了7名參與者的樣本
圖1.10人一生的克隆性造血與多種突變有關
為了進一步描述人一生中克隆情況的變化，研究人員分析了7名73-83歲老年人的造血系統發育情況，基於參與者的體細胞全基因組測序結果構建了包括1731個突變的造血譜系特徵。
分析顯示，DNMT3A突變克隆主要在生命早期啟動和擴充套件，但在老年時增長速度減慢。而TET2突變在人生的各個階段都能被發現，帶來的增長也更為穩定。這一克隆行為上的差異可能解釋了TET2突變在75歲之後能超越DNMT3A成為最常見的克隆性造血突變。研究還發現，U2AF1和SRSF2-P95H突變所驅動的克隆性造血僅在生命後期出現表現出最快的擴增速度。
圖1.11克隆性造血擴增速度與AML風險有關
最後，研究探索了克隆性造血擴增速度與惡性疾病之間的關係。在之前急性髓性白血病（AML）風險預測研究的基礎上，研究人員量化了髓系癌症中不同基因突變的選擇壓力。
結果發現，與克隆性造血較快增長速度相關的突變也與較高的急性髓性白血病風險有關（R2=0.55，p=0.004），在急性髓性白血病和骨髓增生異常綜合徵中處於最強的選擇壓力之下（R2=0.19，p=0.002）。
圖1.12 LBA-2總結
研究人員指出，這項研究描述了克隆性造血在人一生中的自然發展史，並探索了體細胞突變、衰老和克隆選擇之間的相互作用。
LBA-4：綜合手段確認UBTF-TD AML亞型，指導AML患兒風險分層
AML兒童患者複發率高、預後不佳，但目前導致兒童AML患者復發的分子基礎還不完全清楚。近來，RNA測序、全基因組測序和靶向捕獲測序（target-capture sequencing）被應用到了兒童AML患者復發的研究之中。在ASH 2021年大會上，Masayuki Umeda博士就介紹了相關研究的最新成果。
圖2.1 Masayuki Umeda博士介紹了最新進展
圖2.2 25%的兒童AML沒有發現驅動基因
這項由美國田納西州孟菲斯聖裘德兒童研究醫院領銜的研究納入了136名復發的兒童AML患者，使用RNA測序、全基因組測序和靶標捕獲測序對患者開展了綜合的分析。除了在患兒中發現了常見的KMT2A（36例）和NUP98（18例）融合癌蛋白，還發現12名患兒帶有上游結合轉錄因子（UBTF）體細胞突變，佔比達到8.9%。
圖2.3 TBTF在兒童AML患者中頗為多見
圖2.4研究定義了UBTF-TD的AML
在AML患者中很少出現UBTF基因的體細胞突變。這一基因編碼的核仁蛋白是核糖體DNA啟動子的RNA聚合酶I預起始複合物的一個組成部分。研究中發現的體細胞突變不論是在UBTF外顯子13的3’末端還是在整個外顯子13上都可以被描述為雜合的框內外顯子13串聯重複（UBTF-TD）。
圖2.5 UBTF-TD造成的氨基酸水平改變
由於複雜的次級插入和重複的存在，研究使用的技術檢測能力受到了限制。因此，研究人員進一步建立了基於軟剪下讀取的篩選方法來更有效地檢測AML患者中的UBTF-TD，並將其應用在另外417名兒童AML患者的RNA測序資料上。從而15個額外的UBTF-TD，其中有很多以前都未曾報道過。在氨基酸水平上，UBTF-TDs導致了15-181個氨基酸插入，重複了高遷移率族蛋白結構域4（HMG4）的一部分，其中包括富含亮氨酸的短序列。
圖2.6研究分析了27例UBTF-TD的AML
分析發現，UBTF-TD的AML通常發生在青春期早期，患兒的中位年齡為12.6歲，年齡範圍為2.4-19.6歲，27例患兒中有12例核型正常7例8號染色體三體。UBTF-TD與其他複發性融合癌蛋白相互排斥，如NUP98和KMT2A重排，但經常與FLT3-ITD（44.4%）或WT1突變（40.7%）一起發生。
UBTF-TD的中位變異等位基因分數（VAF）為48.0%，範圍為9.7-66.7%。在疾病不同階段資料的4個病例中，相同的UBTF-TD在所有階段均以高VAF存在，表明UBTF-TD是一種克隆性變異。
圖2.7 UBTF-TD的AML具有獨特的特徵
圖2.8 UBTF-TD的AML可以被認為是獨特的亞型
圖2.9 UBTF-TD的AML在兒童青少年中更常見
轉錄組資料的t分佈隨機鄰居嵌入（tSNE）分析表明，UBTF-TD的AML與NPM1突變和NUP98-NSD1的AML亞型表達模式相似，包括NKX2-3和HOXB簇基因。綜上所述，可以我認為UBTF-TD是一種獨特的兒童AML亞型。
圖2.10 UBTF-TD是白細胞發育中發生的事件
圖2.11細胞研究進一步驗證了結論
圖2.12 UBTF-TD足以誘導白血病表型
在一系列的分析工作之後，研究人員還透過細胞實驗進一步驗證了這一結論。為了避免UBTF-TD在原代造血細胞中表達的影響，研究透過慢病毒轉導將UBTF-TD和UBTF野生型表達載體引入臍帶血CD34陽性細胞。結果發現，UBTF-TD表達能促進集落形成和細胞生長，產生具有持久爆炸樣形態的細胞。此外，對這些細胞的轉錄譜分析發現了HOXB和NKX2-3的表達，與UBTF-TD的AML患者類似，表明UBTF-TD足以誘導白血病表型。
圖2.13 UBTF-TD的AML在兒童中更為常見
圖2.14 UBTF-TD的AML預後較差
當然，這一發現還具有一定的臨床意義。研究人員將上述UBTF-TD篩查方法應用於多個新發AML佇列，包括151名的成人TCGA佇列、220名兒童和成人的BeatAML佇列和1035名兒童的AAML 1031佇列。
結果發現，兒童的AAML 1031佇列中有4.3%的患兒攜帶UBTF-TD，而在成年AML患者佇列中僅為0.9%。在兒童的AAML 1031佇列中，UBTF-TDs與已知的AML分子亞型相互排斥，並且通常與FLT3-ITD突變（66.7%）、WT1（40.0%）突變以及正常核型或8號染色體三體一起發生，與之前的研究結果一致。在AAML 1031佇列中，UBTF-TDs還與較差的中位總生存期以及和微小殘留病灶（MRD）陽性有關。多變數分析顯示，UBTF-TD和WT1突變是FLT3陰性ITD陽性AML患者總生存的獨立危險因素。
圖2.15 LBA-4總結
這項研究透過測序分析、細胞實驗和臨床研究定義了一種獨特的UBTF-TD的AML亞型。這一型別的AML之前缺乏明確的致癌驅動因素，但如今UBTF-TD的AML亞型被認為與FLT3-ITD和WT1突變、青春期發病以及不良的臨床預後有關。標準生物資訊學方法並未充分認識到這些改變，而這一研究綜合運用了多種手段，對兒童AML的風險分層具有重要意義。
