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今天推送的文章是2021年11月發表在Angew Chem Int Ed Engl.上的“Engineering a Non-Natural Photoenzyme for Improved Photon Efficiency”，通訊作者是美國康奈爾大學的Todd K. Hyster教授。
光酶是一類新興的生物催化劑，利用光誘導電子轉移促進化學轉化。由於每個催化劑的轉換都需要一個光子，因此有效地利用光激發態是實現高催化活性的必要條件。經過億萬年自然選擇的天然光酶顯示出較高的量子產率（DNA光裂合酶的Φ=0.85，脂肪酸光脫羧酶的Φ=0.80），有利於生產過程而非不希望的途徑。相反，非天然光酶，如黃素依賴性“烯”還原酶（EREDs），顯示出更低的量子效率。例如，來源於Gluconobacter oxydans的ERED（GluER）催化的α-氯醯胺的分子內自由基氫烷基化發生的量子產率Φ=0.024。在該反應中，光激發物是由α-氯醯胺和黃素對苯二酚（FMNhq）組成的電荷轉移（CT）複合物。較低的量子產率是由於逆向電子轉移（BET）比C-Cl鍵的介裂進行得更快。為了提高催化劑的效率，作者猜想蛋白質工程是否能增強系統的激發態動力學。
蛋白質工程是改變生物催化劑性質的有力工具。在現有的策略中，在缺乏機制和結構資訊的情況下，定向進化最佳化酶的能力是值得注意的。作者認為在決定激發態動力學的因素並不明顯的情況下，蛋白質工程可能是最佳化量子效率的一個強有力的策略。然而，在96孔板上進行光酶高通量工程的平臺尚未見報道，這存在挑戰性。例如，光酶反應受光子限制，因此產物的形成與引入反應的光子數量成正比，因此，在每個反應孔中進行一致的照射是必要的。雖然這可能透過為每個孔配備一個單獨的LED來實現，但孔與孔之間的串擾（LED無意中照射到相鄰的孔）引入了額外的可變因素。此外，由於持續照射而引起的板間熱差異可使表現出較高溫度的孔中的蛋白質變性。這些挑戰使得光酶催化無法實現定向進化的能力。
作者選擇GluER透過將α-氯醯胺的自由基環化形成γ-內醯胺作為模型反應，在此基礎上開發了一種新型光酶工程平臺。使用GluER-T36A作為出發點，並使用Lumidox GenI Blue LED陣列在96孔板中照射反應。透過實驗最佳化發現，使用帶有透明基底的白色微量滴定板，同時透過小型風扇冷卻，可在整個板上提供一致的照射和溫度，提供可重複的結果（38.4±2.5 °C和0.16 CV）。在缺乏提高酶的光子效率的明確機制情況下，作者選擇進行易錯突變以製備GluER-T36A突變體文庫。作者鑑定了一種改良的突變體GluER-T36A-K317M-Y343F（此後稱為GluER-G6或G6突變體）。K317位於蛋白質表面，而Y343位於酶活性位點內。對於底物1a，除了提高轉化的對映選擇性外，與野生型（126-TTN）相比，該突變體的活性（600TTN）增加了3.5倍。此外，進化的突變體顯示kcat增加822%。之後作者製備了一系列突變體，其中去除了單個突變，以確定它們對GluER-G6的影響。這些研究表明，Y343F突變對於改善催化功能最為重要，然而GluER-Y343F僅以63%的產率（97:3 er）提供產品，這表明突變效應對效能的不可加性。最後，進一步最佳化反應條件，GluER-G6可以以86%的產率提供97:3 er產品。當野生型酶使用相同的條件時，產物僅以30%的產率形成，er為91:9。
獲得了一種改進的突變體，作者研究了GluER-G6效能改進的根源。圓二色譜分析發現蛋白質熱穩定性的變化可以忽略不計。接下來，作者使用超快瞬態吸收光譜來確定GluER突變體的量子產率。野生型的量子產率Φ=0.024，2.4%的激發態產生產物，剩餘部分進行逆向電子轉移。GluER-T36A是易錯文庫的出發點，其量子產率Φ=0.068，表示量子效率大約提高了2倍。GluER-G6的量子產率Φ=0.105，比野生型提高了4倍，表明激發態動力學發生了顯著變化。為了確定量子效率提高的機理來源，對模型底物的瞬態吸收資料進行了全域性分析，作者比較了各種反應中間體的壽命和相對丰度。作者觀察了包含自由基離子對（黃素半醌（FMNsq）和涉及介裂的自由基陰離子）的酶複合物的光激發事件和相對吸光度。這種離子對在GluER-G6中的吸光度是GluER-WT中的三倍。吸收的增加表明，每吸收同樣的光子，進化後的突變體比野生型酶形成更多的自由基陰離子，表明逆向電子轉移速率降低。該中間體的丰度越大，則越有可能發生介裂，從而提高量子效率。
這些突變體之間最顯著的變化是自由基中間體的壽命。基於之前的研究結果，作者使用FMNsq訊號來確定自由基中間體的壽命。出乎意料的是氧化黃素的形成可能表明反應機理髮生了變化。由於瞬態吸收光譜資料表明對於兩種酶而言光激發引發反應的機制相似，作者進行了同位素標記實驗，以確定終止機制是否發生變化。結果表明兩種突變體之間存在類似的自由基終止機制。基於這些研究，作者認為自由基壽命的差異表明了機制的微妙變化。對於GluER-WT，一種分步機制是有效的，即在自由基終止之前在活性部位內形成離散的自由基中間體。相反，作者認為GluER-G6催化的反應是透過協同反應機制發生的，其中介裂，C-C鍵的形成和氫原子的轉移發生在單一的過渡態內。這種協同機制的證據可以在自由基離子對的壽命中觀察到。
有證據表明存在協同反應機制，作者研究了GluER-G6是否會對其他取代模式或環化模式產生類似的影響。該突變體對涉及叔丁基取代烯烴（3a）的5-exo-trig環化有效，比野生型提高了3倍。在量子產率和自由基壽命方面觀察到類似的變化。有趣的是，GluER-G6對6-exo-trig（4a）和7-exo-trig（5a）環化無效，這表明改進只能轉化為相同環化模式下的替代模式。
之後，作者對酶進行改造以進一步增加其催化效率及底物範圍。由於活性位點突變在改變活性位點動力學中很重要，作者分析了GluER-T36A的晶體結構，以確定預期與底物直接相互作用的位置。作者針對位點W66、Y177、Q232、F269和Y343進行突變，並將每個位置突變為丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸和色氨酸，以獲得不同的大小和靜電特性。最終篩選發現，將66位色氨酸突變為丙氨酸的突變體（GluER-T36A-W66A）被證明更有效，對不同底物的催化效率均有不同提升。
整理:王倩
文章資訊:
PMID: 34739168
DOI: 10.1002/anie.202113842
文章連結:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202113842
