Western blot(蛋白印跡)作為科研中最為平常的實驗，卻蘊含了很多知識，可謂是小實驗裡卻有大文章。儘管絕大多數研究僧都會被WB實驗虐得生無可戀，卻也在和WB鬥志鬥勇的過程中積累了不少經驗。
01
樣品製備和上樣的問題
結論：經過合適樣品製備方法和恰當的蛋白上樣量，在電泳後得到的凝膠，經過考馬斯亮藍、銀染等總蛋白染色的方法所得到的條帶是較為整齊、不拖尾、不彌散、不變形的。
常見的問題與結果分析
問題1：裂解液或樣品緩衝液中的還原劑過多導致泳道邊緣有陰影。
問題2：鹽離子過高、RIPA濃度過高、變性劑濃度過高會導致泳道寬度不一致，泳道變寬。
問題3：樣品過粘，樣品泳道邊緣有縱向條紋，啞鈴型條帶，泳道變寬。
問題4：蛋白質聚集導致形狀詭異的狹窄泳道。
問題5：泳道的蛋白上樣量過高。
解決方案
02
電泳問題
常見的問題與結果分析
電泳出現的問題包括制膠和跑膠，常見的情況具體如下：
問題1：由於配製膠的組分不合理或者溫度、陽光、雜質等外界因素的影響導致丙烯醯胺聚合不完全。
問題2：電泳時溫度影響蛋白條帶的形狀。
問題3：凝膠百分比選擇不恰當，導致濃縮膠效果不好、目標條帶跑出膠外、或目標條帶分離不徹底。
問題4：電泳裝置不完善，內槽漏液導致條帶傾斜。
解決方案
03
轉印問題
常見的問題與結果分析
問題1：膜上殘留氣泡導致的條帶問題。
問題2：轉印過度（轉印膜上條帶量非常少，條帶出現在濾紙上）。
問題3：轉印不足（轉印前後的凝膠的總蛋白對比，差異不大）
問題4：轉印不均勻。
解決方案
04
背景問題
印跡膜曝光時常見的背景問題如下：
問題1：背景過強。
問題2：背景有汙跡。
問題3：背景有斑點。
解決方案
05
非特異條帶問題
問題1：膜曝光時出現目的條帶以外的訊號。
解決方案
06
弱檢測訊號問題
問題1：膜曝光時難以看到條帶訊號。
解決方案
07
Western blot 結果中的背景為什麼較高?
可能的原因及建議
1) 膜封閉不夠——延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。Abcam 推薦 5% 脫脂奶粉、3% BSA 或血清封閉 30 分鐘。這些可以包含在抗體緩衝液中。
2) 一抗稀釋度不適宜——對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
3) 一抗孵育的溫度偏高——建議 4℃結合過夜。
4) 膜在實驗過程中幹過——實驗過程中要注意保持膜的溼潤。
5) 檢測時曝光時間過長——減少曝光時間。
6) 二抗與封閉劑非特異性結合或反應——設定二抗對照(不加一抗)。
7) 一抗或二抗與封閉劑有交叉反應——在孵育和洗滌液中加入溫和去汙劑如吐溫 -20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結合磷酸化特異性抗體而易產生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作為封閉劑。
8) 未結合蛋白質洗滌不充分——增加洗滌次數。
9) 膜的選擇導致的高背景——NC 膜比 PVDF 膜背景低。
08
Western blot 結果中雜帶較多
可能的原因及建議
- 目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙醯化位點等），本身可以呈現多條帶。查閱文獻或進行生物資訊學分析，獲得蛋白序列的修飾位點資訊，透過去修飾確定蛋白實際大小。
- 目的蛋白有其它剪下本——查閱文獻或生物資訊學分析可能性。
- 樣本處理過程中目的蛋白髮生降解——加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。
- 上樣量過高，太敏感——適當減少上樣量。
- 一抗特異性不高——重新選擇或製備高特異性的抗體。
- 一抗不純——純化抗體
- 一抗或者二抗濃度偏高——降低抗體濃度。
- 細胞傳代次數過多，使其蛋白表達不同——使用原始未傳代的細胞株，和現在的細胞株一起做平行對照實驗。
- 檢測到未經報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結構不同的蛋白——查閱其它文獻報道，或 BLAST 搜尋，使用說明書推薦的細胞株或組織。
- 條帶為非特異性條帶——應用封閉多肽來區分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失。
- 靶蛋白形成多聚體——SDS-PAGE 電泳上樣前，煮沸 10 分鐘而不是 5 分鐘，使蛋白質解聚。
09
轉膜，最後能不能出條帶全靠你
經驗總結
1.膠在負極，膜靠近正極；
2.夾好膜和凝膠後，確保凝膠、膜和濾紙之間無氣泡，否則會導致轉膜不完全；
3.注意一定要戴手套或塑膠鑷子接觸膜，避免手上的蛋白和油脂降低轉膜效率；
4.轉膜過程中，尤其是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中；
5.對於溼轉法：一般轉膜的電流在200mA-400mA之間，轉膜時間為30-60分鐘。片段>50KD的可以選用350mA，小片段的可以用250mA。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。
重點來了
VE-586 轉移電泳槽是用來對少量核酸及蛋白質樣品進行轉移電泳的裝置
操作簡便，方便環保
創新設計，同時可 以轉印四塊凝膠
做到一槽多用，可節省實驗空間和經費
效能特點
槽體採用高強度和高透明度的聚碳酸酯材料注塑成型，免除液體滲漏的困擾。
多重安全設計，免除了可能產生的操作安全問題。
安全按鈕式的開蓋設計，方便電泳槽蓋的開啟。
專用開啟式轉移膠架，操作方便。
可同時轉印四塊9×9cm凝膠
專用藍冰盒可反覆使用，方便環保。
轉印時間為15-60min，也可選擇低電壓過夜。
可以與VE-680微型垂直電泳槽配套使用
流行外型設計，精品理念，超越國外同類產品同樣水平。
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看完了以上的分析，大家在Western Blot實驗中遇到的問題是不是都對號入座了呢？歡迎大家在評論區留言分享自己的問題和經驗。
