今天推送的文章發表在Bioresource Technology上的“Effect of manganese peroxidase on the decomposition of cellulosic components: Direct cellulolytic activity and synergistic effect with cellulase”，通訊作者為韓國科學技術研究院的Youngsoon Um等人。
隨著生物煉油廠作為石油煉油廠的替代品的蓬勃發展，脫木素和糖化預處理以獲得可發酵糖是近年來利用木質纖維素生物質作為可持續原料的生物煉油廠的重要課題。各種預處理方法，如蒸汽爆炸和水熱分解，存在缺乏選擇性、能耗高、會產生阻礙微生物發酵的抑制劑等缺點。因此，利用微生物進行生物技術預處理因其優越的選擇性和低能耗而備受關注。白腐真菌(如Phanerochaete chrysosporium)是自然界中能夠大量腐爛木質素的微生物，已被用於生物技術預處理。因此，有必要從木質素、纖維素和半纖維素分解的角度來關注白腐真菌分泌的生物催化劑的意義。
來源於白腐真菌的含血紅素的氧化酶(如錳過氧化物酶[E.C.1.11.1.13]和木質素過氧化物酶[E.C.1.11.1.14])在自然界中通常負責脫木素，而糖化是透過與內切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)等水解酶協同進行。新分類的裂解多糖單加氧酶(LPMO)也透過氧化裂解難降解多糖而參與糖化。這一發現改變了人們對生物催化糖化的理解。鑑於LPMO催化的氧化反應參與了木質纖維素生物質的糖化，作者提出的問題是，木質纖維素生物質的自然轉化是否不僅與水解密切相關，而且與氧化密切相關；如果脫木素和糖化在自然界中可以同時進行，那麼降解木質素的氧化生物催化劑是否能夠像LPMO那樣催化纖維素的氧化分解？為了回答這個問題，作者研究了木質素分解錳過氧化物酶(MnP，E.C.1.11.1.13)是否能催化難降解多糖。
MnP驅動的催化分解纖維素和半纖維素
為了研究木質素降解氧化生物催化劑是否能像LPMO一樣催化纖維素分解，作者首先以羧甲基纖維素（CMC）為可溶性纖維素底物。在木質素分解生物催化劑如木質素過氧化物酶、MnP、多功能過氧化物酶和漆酶中，選擇了來自P. chrysosporium的商用MnP(E.C.1.11.1.13)，因為它能將MnII氧化成高活性MnIII，很容易被羧酸螯合劑穩定，從而透過MnIII-羧酸複合物的非特異性氧化各種底物。透過SDS-PAGE和LC-MS-MS分析，證實商用MnP不含任何其他纖維素降解生物催化劑。如Fig.1(A)的case 7所示，含MnII和H2O2的MnP在pH 4.5(50 mM醋酸緩衝液)下，從CMC中產生623 mg/L的還原糖。只有MnP和CMC加H2O2和MnSO4（case 2和case 4）分別只有120 mg/L和132 mg/L的還原糖。與case 2和case 4相比，case 7中的MnP促進了CMC的有效分解，並從CMC中產生了371 mg/L的還原糖(即從case 7中減去case 2和case 4的還原糖)。由於(i) Fenton反應氧化分解纖維素產生的羥基自由基，(ii) MnII，而不是FeII，通常在酸性pH下催化Fenton反應，因此尚不清楚 Fig.1(A)中的還原糖是由MnP驅動的纖維素分解產生的，還是MnII催化的Fenton反應產生的羥基自由基產生的。同時，陰性對照(case 2和case 4)總共產生252 mg/L的還原糖，而由MnP驅動的CMC分解產生的還原糖(623 mg/L)高2.5倍(case 7)。目前還沒有報道MnP與木腐真菌產生Fenton試劑有關。因此，結果(case 7)是由MnP催化驅動的，而不是Fenton反應。此外，還對山毛櫸木聚糖作為半纖維素底物進行了試驗。類似地，Fig.1(B)表明含H2O2和MnII的MnP與山毛櫸木聚糖作用。Fig.1(B)中的case 7表明，在pH 4.5(50 mM醋酸緩衝液)下，含MnII和H2O2的MnP可從山毛櫸木聚糖中產生470 mg/L的還原糖。只有MnP和CMC加H2O2和MnSO4（case 2和case 4）分別只有120 mg/L和258 mg/L的還原糖。因此，case 7中的MnP促進了山毛櫸木聚糖的有效分解，產生了120 mg/L的還原糖(即從case 7中減去case 2和case 4的還原糖)。
與Fig.1中的結果相反，Joseleau等人(1994)研究了MnIII-有機酸配合物對木材多糖降解的影響，發現MnIII-焦磷酸和MnIII-丙二酸不參與木材多糖的降解。這一矛盾的結果可能是由MnIII-複合物引起的。在本研究中，MnP驅動的CMC和木聚糖在醋酸緩衝液(50 mM，pH4.5)中進行分解，因此MnP驅動的MnIII被螯合到反應性MnIII-醋酸鹽上，後者是能夠在室溫下脫木素的單電子氧化劑，可能在CMC和木聚糖的分解中起作用。為了驗證MnIII-醋酸鹽的作用，使用不同濃度的MnIII-醋酸鹽(0、10、20、50和100 μM)在pH 4.5(50 mM醋酸緩衝液)中進行非生物實驗，其中包括0.1 mM的H2O2。結果表明，來自CMC的還原糖隨著MnIII-醋酸鹽濃度達到50 μM而成比例增加，如Fig.2(A)所示。此外，還觀察到MnP催化的CMC分解依賴於MnII的濃度，當MnII的用量為2 mM時，還原糖達到最大值(Fig.2(B))。當用酒石酸緩衝液(50 mM，pH 4.5)代替醋酸緩衝液生成MnIII-酒石酸鹽，並檢測MnP催化CMC分解，case 7的還原糖與case 5和6的還原糖沒有顯著差異(Fig.2(C))，這意味著MnIII-酒石酸鹽複合物對CMC的分解沒有影響。因此，MnP驅動的MnIII-醋酸鹽對纖維素和半纖維素的分解是必不可少的，這一結論還得到了結晶纖維素底物(即Avicel)的驗證(Fig.2(D))。
MnP可分解各種纖維素和半纖維素衍生物
CMC、pNPC、木聚糖和纖維二糖分別是測定外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的常用底物。在確定比活力之前，作者對每種底物的最適pH和溫度進行了研究。MnP驅動的MnII氧化為MnIII的最適pH和溫度通常分別為pH 4.5和30 °C。如圖Fig.3(A)所示，MnP驅動纖維素分解的最適pH與MnII氧化的最適pH沒有太大不同，但纖維素分解的最適溫度在50 °C −60 °C的範圍內變化(Fig.3(B))。根據阿倫尼烏斯方程，化學反應中的反應速率通常每增加10 °C就增加一倍。因此，MnP驅動的MnIII-醋酸鹽分解纖維素的反應速率隨溫度的升高而增加，而MnP在30 °C 下產生MnIII的反應速率最優。因此，Fig.3(B)中的最佳溫度可能是MnP催化的MnIII生成和MnIII-醋酸鹽驅動的纖維素底物分解之間的折中。Table 1總結了在最佳條件下MnP驅動的纖維素分解的比活性。與纖維素酶或木聚糖酶相比，MnP驅動的纖維素分解對各種底物的比活力較低。然而，根據對CMC、pNPC、纖維二糖和木聚糖的活性，MnP作為多功能的纖維素降解生物催化劑，分別兼具內切、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的活性。因此，MnP不僅能夠協助防止終產物(例如纖維二糖)的抑制，而且對於木質纖維素生物質的糖化也是通用的。
作為MnP驅動分解的底物，作者也對不溶性微晶RAC和結晶纖維素Avicel進行了檢測。Fig.4(A)顯示，MnP催化RAC的分解，可產生187 mg/L的還原糖，轉化率為28.6%。MnP也將17.9%的Avicel轉化為還原糖，如Fig.4(B)所示。由於H2O2驅動的MnP失活通常會抑制MnP的效能，因此可能需要對工藝進行最佳化，如逐步新增H2O2來提高轉化率。為進一步分析，使用SEM對Avicel進行了表徵。MnP催化後在Avicel上觀察到裂紋，而對照樣品中沒有裂紋。相應地，SEM影象表明，MnP在Avicel上起作用，這可能是為了疏鬆和/或裂解晶體結構。
提出的催化機理
由於DNS法已被廣泛應用於木質纖維素生物質糖化過程中可發酵糖的定量，因此MnP驅動的產糖(Fig.1)採用DNS方法進行分析。然而，用DNS方法沒有檢測到LPMO催化的低聚纖維素裂解得到的氧化糖，如葡萄糖酸內酯。用HPLC對纖維二糖的催化產物進行了分析，以確定MnP驅動纖維素分解產生的任何形式的糖。結果沒有檢測到氧化形式(即葡萄糖酸內酯)，主要是葡萄糖的產生：MnP從102 μM的纖維二糖生成205 μM的葡萄糖。
此外，作者還利用LC-MS對來自纖維五糖的MnP驅動的催化產物進行了分析。由於LPMO催化纖維七糖的裂解，然後以內酯、酮醛酸、醛酸和偕二醇的形式生成氧化糖，因此用MnP驅動的纖維五糖催化產物檢測了與氧化糖相對應的分子量峰值。結果表明，MnP產生葡萄糖、纖維二糖、過氧化纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖，但不產生氧化糖。因此，MnP不能催化纖維素底物的氧化裂解，這與以前報道的LPMOs不同。在LC-MS分析的基礎上，作者提出了MnP催化纖維二糖分解的機理：在H2O2存在下，MnP可以將纖維二糖分解為過氧化葡萄糖和葡萄糖，然後過氧化葡萄糖在水相中很容易被水解成葡萄糖。為了在試驗上驗證所提出的機制，還需要在未來的研究中進行13C同位素實驗。
MnP對纖維素酶活性的增強作用
某些蛋白質可以促進纖維素酶對木質纖維素生物質中纖維素成分的水解。例如，expansin是植物細胞壁中的一種非酶蛋白，它輔助傳統的纖維素酶，但它很少表現出分解纖維素的活性。LPMO經常提高纖維素酶活性，並用於纖維素酶複合物中，從木質纖維素中獲得可發酵的糖。為了研究纖維素酶存在下的expansin或類LPMO活性，作者檢測了MnP對纖維素酶活性的增強作用，計算了不同濃度纖維素酶和纖維素的協同程度(DS)(Table 2)。在低濃度CMC(1.0 g/L)和高纖維素酶負載量(5.0單位)下，MnP的促進作用不明顯(DS<1)。由於纖維素酶的用量足以將75.2%的CMC(1.0 g/L)轉化為還原糖，因此所測CMC的量似乎不足以揭示其促進作用。因此，研究了較多的纖維素底物(10.0 g/L)和較低的纖維素酶負載量(1.0單位)的促進作用。使用CMC和Avicel，DS分別達到1.49和1.87(Table 2)。結果表明，MnP除了能直接分解纖維素酶外，還能提高纖維素酶的活性。
作者的研究發現，MnP不僅表現出與內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶相似的纖維素酶分解活性，而且與纖維素酶促進因子一樣提高了纖維素酶的活性。這是第一篇描述除了其主要脫木素活性外，還具有先前未知的纖維素直接分解的MnP活性的報告。作者的研究有助於深入理解自然界中的生物催化糖化作用，並有助於利用木質纖維素生物質作為一種可再生資源來生產具有商業競爭力的生物化學品，以應對氣候變化，這是生物煉油廠長期追求的目標。
整理：孫驍
文章資訊：
PMID：34678456
DOI：10.1016/j.biortech.2021.126138
文章連結：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.126138
