大家好，今天推送的文章來自於發表在Journal of agricultural and food chemistry上的“Significantly Improving the Thermostability and Catalytic Efficiency of Streptomyces mobaraenes is Transglutaminase through Combined Rational Design”，作者為江南大學的陳建。
轉谷氨醯胺酶催化蛋白質中 Gln 和賴氨酸殘基之間的醯基轉移，形成 ε-(γ-谷氨醯基) 異肽鍵。 微生物轉谷氨醯胺酶首先從Streptomyces mobaraenesisS-8112 中分離出來。與那些植物和哺乳動物轉谷氨醯胺酶相比，由S. mobaraenesis(smTG)產生的轉谷氨醯胺酶不依賴於鈣，安全且具有成本效益。目前，smTG 已成為領先的商業轉谷氨醯胺酶產品，並被廣泛用於改善蛋白質食品的質地。 在過去的 15 年中，使用S. mobaraenesis轉谷氨醯胺酶誘導抗體-藥物偶聯的嘗試， 蛋白質的聚乙二醇化， DNA熒游標記， 然後點選化學 擴大了其應用視野。然而，低熱穩定性和比活性嚴重限制了smTG的應用效率。例如，在使用麵筋凝膠或豆腐生產時，轉谷氨醯胺酶介導的反應需要幾個小時才能在 50°C 下發揮作用。 因此，需要構建具有改進的熱穩定性和催化效率的轉谷氨醯胺酶。
smTG 的成功異源表達和啟用提供了對酶進行分子修飾的機會。 一系列理性的、隨機的突變或半理性的 策略已被用於提高 smTG 的熱穩定性或催化效率。為了瞭解催化效能，解析了S. mobaraenesis轉谷氨醯胺酶的晶體結構，並透過與底物 CBZ-Gln-Gly 的分子對接進一步分析了底物結合模型。最近進行了酶-底物類似物複合物的結晶。基於此結構的資訊，二硫鍵被成功匯入到smTG，產生所述變體T7C-E58C，在熔化溫度（4.3℃的增加Ť米）。基於隨機誘變，可以獲得具有顯著增強的熱穩定性 (S2P) 或活性 (S199A)的 smTG 變體。與 smTG 相比，S2P 在 60 °C (t 1/2 (60 °C))下的半衰期增加了 1.71 倍， 而S199A的比活性提高了65%。S2P 將60 °C下的半衰期 (t 1/2 )提高了1.7 倍，而透過 S199A 突變，比活性提高了 65%。在透過具有增強的熱穩定性的飽和誘變獲得的六種 smTG 變體中進行基因改組，導致 smTG 變體 (S23V-Y24N-K294L)在 50°C 下的t 1/2增加了 8.8 倍。透過將兩個突變 S2P 和 S199A 新增到 S23V-Y24N-K294L，最終的變體 S2P-S23V-Y24N-S199A-K294L (TGm1) 在 60°C 下實現了 24.3 分鐘的半衰期，是 11.2 倍smTG。 同時，與野生型 smTG 相比，TGm1 的比活性 (55.7 U/mg) 增加了 1.1 倍。 儘管之前的研究已經透過分子修飾在很大程度上擴充套件了 smTG 的熱穩定性，但仍然需要進一步提高其熱穩定性和各行業的比活性。
迄今為止，開發了許多計算機方法來預測酶穩定或活性增強的“熱點”。一種典型的合理設計方法是降低酶摺疊能以獲得更好的穩定性。 脯氨酸取代可以減少骨架波動，從而導致去摺疊熵降低。 透過使用已發表的資料庫進行訓練，其自由能變化與熱穩定性之間的 Pearson 相關係數達到了0.743，在報告的預測工具（Provean、FoldX、ELASPIC、Amber TI 和 Rosetta ddb_monomer）中預測準確度最高。 另一種合理的方法是基於增強酶分子之間的排斥力，這可以防止蛋白質在高溫下聚集和失活。 選擇酶表面上那些極化或帶電的殘基，並用帶相反電荷的殘基替換，以實現定製數量的淨電荷。這種策略最近成功地穩定了不同的酶。此外，用脯氨酸替代柔性殘基的脯氨酸掃描可以減少骨架波動，從而降低去摺疊的熵。 透過脯氨酸掃描，研究人員發現了一個單一突變 Q706P，該突變可導致在 60°C 下處理 30 分鐘的酸支鏈澱粉芽孢桿菌的殘留活性增加 36.4% 。對於催化效率改進，酶和底物之間的相互作用表現為與酶活性負相關的結合自由能。 Discovery Studio (DS)已被廣泛用於透過虛擬誘變預測蛋白質-配體結合能的變化。 應該指出的是，最佳配體對接姿勢的選擇仍然是預測的一個挑戰。
在本研究中，作者嘗試使用組合合理設計進一步提高TGm1的熱穩定性和催化效率。為了鑑定有利於熱穩定性的突變，進行了基於 Rosetta Cartesian_ddg 的脯氨酸掃描，以發現摺疊自由能降低的 TGm1 變體。為了提高比活性，使用 Discovery Studio 計算突變能量（結合）對與 CBZ-Gln-Gly 結合的 FRAPD-TGm1 的模型結構進行虛擬飽和誘變，對 Cys64 的 15 Å 內的殘基進行虛擬飽和誘變。Rosetta Cartesian_ddg 進一步篩選了那些結合自由能降低的虛擬變體。最後，酶表面的負淨電荷是使用 Rosetta Supercharge 設計的，經過修飾以防止高溫下的蛋白質聚集。在結合上述方法預測的有利突變後，作者獲得了具有顯著熱穩定性和催化效率提高的TGm1變體。還使用β-酪蛋白作為底物檢查了它們對蛋白質的催化效率。還基於分子動力學 (MD) 資料討論了增強熱穩定性和活性的機制。
在本研究中，作者試圖進一步提高 TGm1 的催化效能，TGm1 是一種高度穩定的鏈黴菌轉谷氨醯胺酶變體，帶有五個殘基突變（S2P、S23V、Y24N、S199A 和 K294L）。鏈黴菌轉谷氨醯胺酶天然合成為轉谷氨醯胺原酶，其原區域透過啟用蛋白酶切割，產生活性轉谷氨醯胺酶。據報道，在前區 N 端與 TrxA 融合可以顯著提高前轉谷氨醯胺酶在大腸桿菌中的表達。此外，研究人員還發現，透過用其他轉谷氨醯胺酶的原區替換其原區，可以增強轉谷氨醯胺酶原的表達。 透過分析 TrxA 和不同前區（未公開資料）的影響，TrxA 和來自S. hygroscopicus轉谷氨醯胺酶的前區融合到 TGm1 的 N 端並在大腸桿菌中成功表達。眾所周知，smTGase 的天然前區以 FRAP 結束，使用 dispase 的活化在活化酶的 N 端留下了一個額外的 FRAP。相比之下，來自吸溼性鏈球菌轉谷氨醯胺酶的前區預計以 FRAPD 結束。因此，分散酶的體外活化將具有 TrxA 的 TGm 和吸溼鏈球菌前區轉化為活性 FRAPD-TGm，與天然 smTG 相比，其 N 端具有額外的五肽（FRAPD）。
FRAPD-TGm1 的 3-D 結構分別由 I-TASSER 和 Rosetta Relax 生成和改進。與 smTG 的晶體結構相比，FRAPD-TGm1 的模型結構顯示出 1.46 Å RMSD 差異。基於建模的結構，作者開發了一個指令碼，可以使用 Rosetta Cartesian_ddg 對 FRAPD-TGm1 的整個序列進行脯氨酸掃描。摺疊自由能變化小於 -1 kcal/mol 的變體應該具有比 FRAPD-TGm1 更高的熱穩定性。在選定的變體中，成功表達和純化了六個變體。然後，作者使用T m （一種熱力學穩定性引數，涉及酶抵抗解摺疊過程的能力）來表徵變體。 如圖所示，A166P、A265P 和 A287P 分別導致T m升高 0.26、0.69 和 2.13 °C 。此外，這三種變體的比活性也增加了 7.1-22.5%。這些結果表明 FRAPD-TGm1 可以透過降低其摺疊來提高穩定性。
基於上述建模結構，作者使用DS靈活對接構建了42個FRAPD-TGm1/CBZ-Gln-Gly對接結構。通常，smTG 介導的醯基轉移反應是由活性殘基 Cys64 對 CBZ-Gln-Gly 中的 Gln 殘基的親核攻擊引發的。因此，硫醇基團（在 Cys64 上）和醯基胺（CBZ-Gln-Gly）之間的距離對於催化反應至關重要。在對接結構中，只有帶有位姿 8、10 和 39 的結構表明硫醇基團與醯基胺之間的距離小於 4 埃。因此，使用 DS 計算突變能（結合）對三種結構進行酶-底物結合親和力分析，產生 15 種結合能低於 -0.8 kcal/mol 的虛擬變體。為了估計突變對酶穩定性的影響，作者使用 Rosetta Cartesian_ddg 進行了摺疊能量預測。如圖所示B，15 個虛擬變體中的 9 個表現出結合自由能的明顯增加 (>1 kcal/mol)，表明與 TGm1 相比，這些變體的穩定性較低。因此，剩餘的 TGm1 變體（Y302R、D255W、V252W、V252F、E28T 和 D304R）被表達為進一步表徵。V252F和D255W均表達為不溶性包涵體（資料未顯示），作者成功表達並純化了其中的四種（Y302R、V252W、E28T和D304R）。在不顯著影響T m 的情況下，突變 E28T 使 FRAPD-TGm1 的比活性增加了 23.7%。相比之下，Y302R、V252W、V252F、E28T 和 D304R 對 FRAPD-TGm1 活性有輕微或不利的影響。
為了進一步提高催化效能，在 FRAPD-TGm1 中同時進行有利突變（E28T、A265P 和 A287P），產生變體 FRAPD-TGm1-E28T-A265P-A287P（FRAPD-TGm2）。與T m不同，t 1/2是一個動力學穩定性引數，它表示酶在特定溫度下保持反應效率的能力，這對酶的應用效率更為關鍵。因此，除了T m之外，作者還使用t 1/2來評估組合變體的熱穩定性。在 60 °C 下孵育時，FRAPD-TGm1 和 FRAPD-TGm2 的活性在前 5 分鐘內顯著降低，而後者在隨後的孵育過程中保持相對較高的殘留活性。最後，FRAPD-TGm2的t 1/2 (60 °C) 達到 66.9 分鐘，是 FRAPD-TGm2 的 2 倍。此外，與 FRAPD-TGm1 相比，FRAPD-TGm2 的T m也增加了 2.6 °C 。透過測量最佳反應溫度，FRAPD-TGm2 在所有測試反應溫度下表現出比 FRAPD-TGm1 更高的比活性。FRAPD-TGm2 在 50 到 60°C 的溫度範圍內保持最高活性，而 FRAPD-TGm1 的最佳溫度被限制在一個點（55°C）。
使用乳蛋白β-酪蛋白作為底物研究由smTG變體產生的蛋白質交聯。在smTG變體介導的催化反應過程中，β-酪蛋白條帶（約28 kDa）逐漸變細，同時在濃縮膠和分離膠的介面處聚集了許多蛋白質條帶，表明發生了蛋白質交聯。 反應 10 分鐘後，FRAPD-TGm2 和 FRAPD-TGm3 將大部分 β-酪蛋白帶轉化為交聯帶。然而，在 FRAPD-TGm1 的情況下，即使在反應 30 分鐘後仍然可以看到清晰的 β-酪蛋白帶。然而，在 FRAPD-TGm1 的情況下，即使在反應 30 分鐘後仍然可以看到清晰的 β-酪蛋白帶。然後，將在 5 分鐘時取出的反應溶液用 8 M 尿素處理並進行 SEC 分析。由於尿素與牛奶蛋白 β-酪蛋白的洗脫時間相似（資料未顯示），兩種組分的洗脫時間均為 290–305 分鐘（峰 1）。與 FRAPD-TGm2 的反應在 88-100 分鐘（峰 1）誘導最高吸光度，FRAPD-TGm3 次之。除了峰 1，FRAPD-TGm1 還在 160-170 分鐘（峰 2）處產生一個小峰。在 SEC 中較早的時間（峰 2 和峰 3）洗脫表明由 smTG 變體誘導的聚集體的形成。相比之下，FRAPD-TGm1 在三個 smTG 變體中具有最高的峰值 3。這些結果表明 FRAPD-TGm2 對 β-酪蛋白表現出最高的活性。
FRAPD-TGm3、FRAPD-TGm2 和 FRAPD-TGm1 的 MD 模擬在 330 K 下進行 50 ns，以瞭解穩定機制。如圖所示，FRAPD-TGm2 的平均和最終 RMSD 值（平均值：0.1666；最終：0.1414）均低於 FRAPD-TGm1（平均值：0.1705；最終：0.1943），表明結構剛度更高FRAPD-TGm2。然而，RMSF 分析表明 FRAPD-TGm2 在殘基 28、265 和 287 周圍的靈活性沒有比 FRAPD-TGm1 表現出顯著變化。應該注意的是，與 FRAPD-TGm1 相比，殘基 207-209 和 246-250（位於 FRAPD-TGm2 的催化裂隙中）的 RMSF 值顯著降低。出乎意料的是，FRAPD-TGm3 的結構（平均 RMSD：0.184；最終 RMSD：0.2081）比 FRAPD-TGm1 和 FRAPD-TGm2 的結構更靈活。與 FRAPD-TGm2 相比，FRAPD-TGm3 中的所有額外突變都增加了圍繞突變位點的靈活性，除了 S144E。
酶-底物複合物的 MD 模擬在 300 K 下進行 50 ns，以瞭解 FRAPD-TGm2 和 FRAPD-TGm3 的穩定機制。使用 DS 靈活對接獲得了 CBZ-Gln-Gly 和 FRAPD-TGm2 或 FRAPD-TGm3 之間的 84 個和 58 個對接姿勢。具有最低 CDOCK 能量和硫醇基團與醯基胺之間距離小於 4 Å 的位姿用於 MD 模擬。如圖所示酶和CBZ-GLN-甘氨酸變為後3ns的模擬穩定兩者的RMSD，和CBZ-GLN-甘氨酸在FRAPD-TGM1表現出比FRAPD-TGM2和FRAPD-相對較高的方差TGm3。與 FRAPD-TGm1 相比，FRAPD-TGm2 在 N 端區域 (DPDDR) 和殘基 287（殘基 282-284）上游的靈活性顯著降低，它們在空間上接近殘基 28 和 287。在 FRAPD-TGm3 中也觀察到這兩個區域的類似下降。與 FRAPD-TGm1 相比，FRAPD-TGm2 在 50 ns 模擬過程中顯示，殘基 282-284 和 1-5 之間的氫鍵平均數量增加了 22.1 倍，而 FRAPD-TGm3 的平均氫鍵數量增加了 33.7 倍。需要注意的是，在第一個 23.16 ns 模擬中，FRAPD-TGm1 中的 N 端區域 (DPDDR) 和 CBZ-Gln-Gly 之間沒有可檢測到的氫鍵。相比之下，在以下模擬中，N 端和底物殘基之間的氫鍵平均數達到 1.58。相反，FRAPD-TGm2 和 FRAPD-TGm3 中氫鍵的平均數量分別減少到 1.04 和 0.1698。
整理：張經緯
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DOI:10.1021/acs.jafc.1c05256
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