氮元素是生命體中僅次於碳、氫和氧的第四大元素。氮原子透過形成碳-氮鍵、氮-氫鍵和氮-氧鍵等方式成為氨基酸和核苷酸等含氮小分子的重要結構組分。然而，自然界中含有氮-氮（N-N）鍵的天然有機小分子數目相對較少，這可能是由於氮原子本身親核的化學特性，使得在兩個氮原子之間直接形成氮-氮鍵是化學上比較困難的反應。
自然界中已經發現數百個的含有氮-氮鍵基團的天然有機小分子中包括了眾多具有多種多樣分子結構與生物學活性的微生物次級代謝產物。相比於天然來源的此類分子，在化學合成來源的臨床藥物中，氮-氮鍵則是出現頻率很高的關鍵結構基團。例如，在抗病毒藥物中最重要的核苷類家族裡，就包括了含有氮-氮鍵的瑞德西韋（Remdesivir）和利巴韋林（Ribavirin）（圖1）。
微生物來源的含有氮-氮鍵的天然核苷類分子吡唑黴素（pyrazomycin）和間型黴素（formycin）也具有很好的抗病毒活性。這些核苷結構類似物在體內能夠轉化為其對應的活性三磷酸形式進而干擾病毒複製等正常的生理代謝過程。相比於生物體內其他的合成代謝過程，目前對氮-氮鍵在自然界中的形成過程知之甚少，其酶促合成的生物化學機理也是當前合成代謝領域最前沿的科學問題之一。
圖1. 含有氮-氮（N-N）鍵結構基團的抗病毒藥物分子（包括瑞德西韋和利巴韋林）
2021年12月10日，國際學術權威刊物《Nature Communications》雜誌線上發表了來自浙江大學基礎醫學院/浙江大學醫學院附屬第一醫院杜藝嶺課題組的研究論文“Molecular basis of enzymatic nitrogen-nitrogen formation by a family of zinc-binding cupin enzymes”。
在這項研究中，研究者透過對微生物來源的天然抗病毒分子吡唑黴素（pyrazomycin）中氮-氮鍵基團形成的生化機理的研究，揭示了一類鋅離子依賴型氮-氮鍵合酶介導肼基（-NH-NH-）形成的詳細生化過程和催化機理（圖2）。
圖2. 抗病毒藥物吡唑黴素中氮-氮（N-N）鍵結構基團酶促合成的生化基礎
在本文中，研究者透過同位素示蹤、體外生物化學反應重構、反應中間體結構鑑定等方法，揭示了在吡唑黴素生物合成過程中，雙功能域蛋白PyrN的類似於氨醯-tRNA合成酶的C末端結構域（MetRS-like domain）能夠利用ATP啟用穀氨酸形成谷氨醯腺苷酸，後者繼而與羥化賴氨酸縮合形成一個高度不穩定的酯中間體（圖2）。
PyrN的N末端Cupin結構域能夠捕獲該活性中間體，並將其轉化為含有氮-氮（N-N）鍵連線的產物。在PyrN的cupin結構域缺失的情況下，由C末端結構域產生的活性酯中間體會在溶液中迅速發生自發的分子內重排形成含有醯胺鍵的副產物。
進一步的蛋白結構分析、關鍵氨基酸殘基定點突變與理論化學計算分析表明，該新穎氮-氮（N-N）鍵的酶促合成反應嚴格依賴於Cupin結構域中結合的鋅離子與關鍵的天冬氨酸殘基Asp69。在以上兩者的協同作用下，酯中間體在酶活性中心發生氮-氧（N-O）鍵斷裂後重新形成氮-氮（N-N）鍵。
此外，本文還透過蛋白質資料庫挖掘和酶活測定，發現了多個能夠接受不同氨基酸底物的該氮-氮鍵合酶家族的新成員，提示了本研究報道的氮-氮（N-N）鍵合成的生化反應是自然界普遍存在的一種微生物合成代謝策略（圖3）。
圖3. 自然界中一種保守的用於構築氨基酸肼基衍生物的生物合成策略
綜上，本研究報道了一種普適性的鋅離子依賴型氮-氮鍵基團酶促合成的生物化學反應過程，揭示了微生物合成代謝過程的一種新的生化機制。同時，鑑於氮-氮鍵基團是眾多臨床藥物分子的關鍵藥效團，該成果也將為透過合成生物學技術構築相關藥物分子提供催化元件和理論指導。
本文的第一作者為浙江大學基礎醫學院杜藝嶺課題組博士生趙桂雲和廈門大學化學化工學院王斌舉教授課題組博士生彭煒。論文主要通訊作者為浙江大學基礎醫學院杜藝嶺研究員，共同通訊作者王斌舉教授為該研究提供了理論化學計算的支援。該工作受到國家自然科學基金委專案和浙江省自然科學基金專案的支援。
實驗室簡介
杜藝嶺課題組長期招聘微生物合成生物學、天然產物化學和結構生物學的博士後與研究助理，有意向者歡迎郵件交流：[email protected]。
課題組網站：http://person.zju.edu.cn/yiling_du
