眾所周知，免疫細胞的協調在許多重要的組織功能中都起到關鍵作用，例如傷口癒合，組織穩態或病毒清除等等[1]。

在抗癌反應中它們也同樣有著關鍵且複雜的作用。不同腫瘤雖然在起源組織和突變上有著很大區別，但它們在與免疫系統的抗衡中都會建立對自身起到保護作用的腫瘤免疫微環境（TME）。

現有的腫瘤免疫研究通常會把腫瘤描述為“熱”（免疫浸潤）或“冷”（稀疏浸潤）腫瘤[2]。研究也已經揭示了一些特定的免疫細胞亞群在腫瘤免疫中起到的作用以及它們之間的關係，如樹突狀細胞（cDC1，cDC2）[3, 4]，CD8/CD4 T細胞[3]，調節性T細胞（Treg）[4]和自然殺傷（NK）細胞[5, 6]等。

然而，這些描述還並不完整，腫瘤TME中免疫細胞的組成是否與腫瘤生物學背景和其他細胞組成有關仍有待解答[7]。

近日，來自加州大學舊金山分校的Matthew F. Krummel教授團隊在《細胞》上發表了他們的免疫分析計劃（Immunoprofiler Initiative，IPI）的重要研究結果[8]。

他們提出，比起單一細胞型別的狀態，我們更應該關注不同細胞的集合以及其他們綜合反映出的免疫狀態。Krummel團隊據此定義出了不同癌症中的12種“免疫原型”（immune archetypes）。

他們發現，免疫原型不僅可以根據免疫基因表達區分腫瘤，還完善了腫瘤生物學分類。有趣的是，IPI研究中多次發現不同癌種可能來自同一免疫原型，並可作為評估預後的標準。這更新了現有的癌症分類思路，未來針對調節特定免疫原型的療法或許能讓更多病人獲益。

論文首頁截圖

為了發現主要的免疫系統原型，IPI首先使用無偏見方法（即不知道腫瘤型別，分期和等級的情況下）統一收集和處理了來自12種不同癌症的 364 個腫瘤樣本。

Krummel團隊將樣本快速消化成單細胞懸液，並使用多引數流式細胞術進行了免疫表型分析和細胞分選。樣本細胞被分為（1）所有活細胞，（2）常規CD4+和CD8+ T細胞（Tconv ），（3）CD25+CD4+ T細胞（Treg ），（4）HLA-DR+髓細胞，（5）CD45-CD44+Thy1+基質細胞，和（6）所有其他CD45-細胞（癌細胞），並用這些細胞池進行了批次RNA測序（bulk RNA-Seq）。

IPI腫瘤樣本資訊（活細胞批次RNA-seq樣本數，流式細胞分析樣本總數）和流式細胞分析和分選過程

Krummel團隊對分選後的腫瘤相關T細胞，髓細胞和基質細胞的高質量RNA-seq資料進行了差異基因表達（DGE）分析，分別篩選出了25個T 細胞基因，29個髓細胞基因，和21個基質細胞基因。

透過用這三種基因特徵，Krummel團隊為腫瘤樣本進行了評分，他們用基因評分測定的細胞丰度與流式細胞分析結果顯示出了高度一致。T 細胞，髓細胞和基質細胞的Spearman相關性分別高達0.91，0.90，和0.94。

基因評分和流式細胞分析測定的T細胞，髓細胞和基質細胞丰度結果

接下來，Krummel團隊用他們定義的3種細胞的基因特徵分別對IPI和TCGA基因樣本進行了無監督聚類分析（K-近鄰演算法和Louvain社群發現演算法）。

他們在IPI和TCGA資料中都發現了6個叢集，即6種免疫原型。其中包括了兩個富集T細胞和髓細胞、由基質細胞表達區分的富含免疫細胞的原型（以下簡稱為富含免疫[immune rich, IR]和富含免疫基質[immune stromal, IS]）；基質細胞的表達同樣區分了兩個缺少T細胞和髓細胞的免疫沙漠（immune desert, ID）和免疫基質沙漠（immune stromal desert）原型。

最後兩個原型是僅富集一種免疫特徵的T細胞（T cell centric, TC）原型和髓細胞（myeloid centric, MC）原型。

3特徵聚類分析中產生的6種原型（3-f原型）

接下來，Krummel團隊透過分析六種免疫原型在IPI和TCGA樣本中的分佈，試圖評估了簡單的原型分類是否與癌症預後有關。

結果顯示，雖然一些腫瘤型別（如黑色素瘤，腎臟、膀胱和結腸直腸癌）的原型分類與生存結果有一定關係，但總的來說6種原型與多種癌症的預後沒有顯著關係。於是作者們認為，僅用3種特徵計算的原型無法涵蓋腫瘤免疫細胞的異質性。

結合流式細胞分析資料，Krummel團隊細化了原演算法中T細胞的分類。首先他們按癌症型別對腫瘤進行了分組，以對比活細胞中Treg和CD4+或CD8+ Tconv細胞的數量。這一步的結果顯示，不同腫瘤中的Treg和Tconv分數有很大差異。

不同癌症中的Treg，CD4和CD8 T細胞數量

接下來，作者們用Treg RNA-seq與其他細胞的測序結果進行了DGE分析，找到了對應Treg細胞的基因特徵。

根據流式細胞分析資料，作者們選取了富含CD4和CD8 Tconv 的樣本進行DGE分析，找出了對應的細胞基因。

加入新的基因特徵之後，Krummel團隊接下來進行的6特徵聚類分析產生了8個免疫原型。兩個新的原型分別是先前粗略IR和IS原型的細分，各產生了CD4和CD8偏差（CD4/CD8 biased IR/IS）的原型。

此外，之前3特徵分析中的免疫基質沙漠原型相對富含CD8，而ID則富含CD4 T細胞。

6特徵聚類分析中產生的8種原型（6-f原型）

接下來，Krummel團隊對原型中的髓細胞特徵也進行了細化。

眾所周知，髓細胞在組織中有著多變的分化和功能。因此，作者們首先用流式細胞分析探測了每種原型中的單核吞噬細胞（mononuclear phagocytes, MNP）亞群，包括單核細胞（Mo），巨噬細胞（Mp），經典樹突狀細胞（cDC2，cDC1）和漿細胞樣樹突狀細胞（pDC）。

結果發現，儘管原型之間略有不同髓細胞丰度的差異（如IR CD4偏差原型中cDC2的丰度高於cDC1），但總體來說，髓細胞的表達（包括cDC1/cDC2的比例，單核細胞和巨噬細胞丰度）在8種原型中都高度可變。

為了能更準確的測量癌症樣本中髓細胞的多樣性和密度，作者們對腫瘤相關MNP進行了單細胞測序（scRNA-seq），以確定主要的MNP亞群及他們的基因特徵。

作者們首先透過3,880 個MNP細胞的基因聚類分析找到了5個叢集，再進一步用每個叢集之間的DGE分析得出了他們的特徵基因。最後，他們用流式細胞分析驗證了這些MNP 子集的基因特徵在腫瘤相關髓細胞的批次RNA-seq中生成的評分。MNP子集的基因與流式細胞分析評分在所有癌症型別均呈高度相關（單核細胞，巨噬細胞，cDC2，cDC1和pDC的 Spearman相關性分別為 0.86，0.91，0.93，0.94 和 0.94）。

據此，Krummel團隊又在前6個特徵的原型分析中添加了四個MNP子集特徵（包括巨噬細胞，單核細胞和兩種經典樹突狀細胞）。這10個免疫特徵的聚類分析產生了 12 種不同的腫瘤免疫原型（10-f原型）。

10特徵聚類分析中產生的12 種原型（10-f原型）

Krummel團隊發現，12種原型中，IR和ID原型都可以透過T細胞和髓細胞亞群的不同配對來區分。具體來說，單核細胞/巨噬細胞比例區分了兩種不同的IR CD8偏差原型，其中Treg的丰度通常在巨噬細胞富集的腫瘤標本中較高。

10-f原型之間的細胞丰度對比

Krummel團隊接下來結合未用於聚類的基因資料進行了分析，以進一步闡明不同原型之間的免疫差異。

他們分析了髓細胞特徵基因組和其他12個與免疫細胞（包括 Treg，Tconv，B 細胞，漿細胞和 NK 細胞亞型）有關的基因組在對應細胞群中的表達（如Tconv RNA-seq中輔助性T細胞[Th1]基因的表達，髓細胞RNA-seq 中M1基因的表達等）。

組合基因組的分析結果揭示了每種原型之間不同的免疫反應。例如，IR CD8巨噬細胞偏差（IR CD8 macrophage bias）原型的腫瘤樣本在 Tconv和MNP基因組中上調了1型反應相關基因的表達（即干擾素γ[IFNγ]，腫瘤壞死因子[TNF]，白細胞介素[IL]-1β等），而ID CD8原型的樣本則上調了T細胞耗竭相關基因（PDCD1，CTLA4 和 ENTPD1）和M2樣巨噬細胞相關基因（PDCD1L2，CD163，CD274 和 MRC1）的表達。

10-f原型的免疫基因表達

作者們還發現，10-f 原型的分類有腫瘤生物學意義。

如之前所示，10-f腫瘤原型來自不同癌症樣本，然而透過流式細胞術測量的腫瘤增殖力（Ki67+腫瘤細胞比例）結果顯示，ID和MC原型與高繁殖力有密切關係。

10-f原型腫瘤繁殖力對比

最後，Krummel團隊用TCGA資料進行了10-f原型在不同癌症中的生存分析。

結果顯示，不同癌症中更好的生存結果來自不同原型。也就是說，每種癌症可能需要不同型別的TME來促進最佳免疫反應。

進一步的多變數生存迴歸分析結果顯示，具有相似T細胞亞群的原型之間有顯著的生存差異，而這一結果與起源組織無關。

例如，對比CD8 T細胞富集的原型時，相較於IS CD8， ID CD8，和巨噬細胞富集的IR CD8原型，單核細胞富集的IR CD8原型有著最好的生存結果（中位生存期3354 天，p=1.55E-12 )。反之，CD4 T 細胞富集的4種原型則沒有生存結果上的差異（p=3.01E-1）。

而在沒有T 細胞亞型偏差的原型中，以巨噬細胞比單核細胞富集為特徵的TC原型有最高的中位生存期（2456 天，p=1.17E-6）。

T細胞亞型分類的10-f原型生存分析

總的來說，這項研究透過RNA-seq分析確定了不同癌症TME中的細胞組成，並發現了12種腫瘤免疫原型。腫瘤原型為研究各種人類原發性癌症中不同亞型的抗腫瘤免疫反應，及其與腫瘤生物學背景之間的關係提供了新思路。未來或許可以透過調節不同原型中特定的免疫機制在治療上給出個性化的最優解。

參考文獻：

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