近日，中科院遺傳發育所高彩霞團隊、肖軍團隊和中科院微生物所邱金龍團隊合作發現感病基因MLO突變的Tamlo-R32突變體不僅被賦予強大的白粉病抗性，同時也保留了小麥的生長與產量的優勢，成果在Nature（IF=49.962）上發表。作者透過cut&tag、ATAC-seq、RNA-seq與基因組編輯等多組學技術手段，成功對小麥白粉病抗性和產量兼得的遺傳改良途徑進行剖析。
安諾優達有幸為本研究提供了ATAC-seq、4C測序和轉錄組建庫測序服務，為挖掘新型突變體抗病高產的分子機制提供助力！帶著滿滿的好奇心，下面就和小編一起來學習如何利用高通量測序技術探索作物遺傳改良的奧秘~
研究背景
小麥白粉病是威脅小麥產量的主要病害之一，而分子育種被認為是提高植物抗病性的有效且可持續的重要策略。然而利用感病基因進行抗病育種常年面臨著抗病株的生長髮育和產量均出現嚴重缺陷的難題。破壞作物的感病（S）基因是賦予作物抗病能力的一種具有前景的育種策略。但破壞S基因的行為是一把雙刃劍，在作物抗病性提升的同時，往往會犧牲產量，這極大地限制了其在植物抗病育種中的應用。本篇研究歷經8年，不僅成功剖析小麥新型mlo突變體既抗白粉病又高產的調控機制，又證明基因組編輯技術的應用有望支援和滿足未來可持續性抗病作物的發展需求，這對於開發具有強大和持久抗病性的高產作物品種至關重要。
材料選擇
野生型和Tamlo-R32突變體小麥
測序策略
全基因組重測序：NovaSeq PE150測序深度50X
RNA-seq、4C-seq、ATAC-seq、CUT &Tag：NovaSeq PE150
技術路線
研究結果
1.Tamlo-R32抗白粉病，且無生長缺陷
作者在使用TALEN載體產生的小麥mlo突變體中，成功鑑定了Tamlo-R32突變體。該突變體表現出對白粉病強大的抗性，且株高和穀物產量方面沒有表現出生長缺陷。
圖1 Tamlo-R32抗白粉病且無生長缺陷
2. Tamlo-R32在TaMLO-B1附近產生304 Kb大片段缺失
作者接下來對Tamlo-R32抗性相關的突變進行探究。Tamlo-R32 突變體中共有3個小麥MLO1基因，作者透過基因特異性引物擴增和基因雜交發現Tamlo-R32中的抗性等位基因與TaMLO-B1 基因座緊密相關。全基因組測序表明其染色體4B上發現了一個304 Kb大片段缺失。缺失的右邊界位於TaMLO-B1的第二個外顯子，左邊界終止於MLO 基因（以下稱為TaMLOX）。
圖2 Tamlo-R32在TaMLO-B1附近產生304 Kb大片段缺失
3. 挽救Tamlo-R32生長缺陷的TaTMT3B表達調控機制
為了研究Tamlo-R32中大片段缺失的影響，作者透過RNA-seq測序發現缺失上游的TaTMT3B基因相對於野生型Bobwhite在Tamlo-R32中顯著上調，進而導致TaTMT3的總水平增加。
透過cut&tag和ATAC-seq檢查TaTMT3B-MLO-B1區域中的組蛋白修飾和染色質可及性，並輔以染色體構象捕獲測序（3C-seq）和環狀 3C-seq（4C-seq）技術，發現野生型中TaTMT3B 被H3K27me3（參與形成導致基因沉默的長程染色質環）標記的啟動子與遠端基因座成環，而Tamlo-R32中大片段的缺失消除了TaTMT3B 啟動子和缺失區域（a-c 環）之間的染色質環，表明TaTMT3B的轉錄受到抑制性組蛋白標記H3K27me3和野生型Bobwhite中抑制性染色質環的影響，而Tamlo-R32中的片段缺失消除了表觀遺傳抑制，並在TaTMT3B周圍創造了一個致其上調的染色質環境。
圖3 TaTMT3B表達調控示意圖
4. 利用多重基因組編輯快速獲得抗白粉病小麥新種質
基於以上研究結果，作者利用CRISPR-Cas9技術來開發含有Tamlo-R32 等位基因的新小麥種質。使用僅具有兩個sgRNA 的CRISPR–Cas9 DNA或RNP將Tamlo-R32 等位基因快速引入優質小麥品種，最終精確編輯四個優良冬小麥品種中的MLO基因座。這些結果證明了相比於基因滲入，基因組編輯是將Tamlo-R32等位基因快速引入優質小麥品種的有力策略。
圖4 使用CRISPR–Cas9 技術將Tamlo-R32等位基因快速引入優質小麥品種示意圖
研究結論
感病基因MLO的突變使病原微生物侵染能力下降，植株表現出抗病表型，但往往其生長和產量均受到負面影響。與其他突變體不同的是，Tamlo-R32突變體內發現一個304 Kb染色體片段的缺失。作者透過染色體三維空間圖的繪製與轉錄組分析，發現其染色質三維空間結構發生重排，表觀的遺傳變化導致上游編碼液泡膜單糖轉運基因TaTMT3顯著上調，這恰好恢復了Tamlo-R32材料的生長和產量。該團隊透過雜交和多代回交，將MLO突變和染色體缺失片段一起匯入優良小麥品種中，獲得了抗白粉病且高產品系的快速創新。
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參考文獻
[1] Li S, Lin D, Zhang Y, Deng M, Chen Y, Lv B, Li B, Lei Y, Wang Y, Zhao L, Liang Y, Liu J, Chen K, Liu Z, Xiao J, Qiu JL, Gao C. Genome-edited powdery mildew resistance in wheat without growth penalties[J]. Nature. 2022 Feb 9.
文案：產品經理 邱美琪
