大家好，今天推送的文章來自於2021年11月發表在Science of The Total Environment上的A combination of bioinformatics analysis and rational design strategies to enhance keratinase thermostability for efficient biodegradation of feathers，通訊作者是江南大學的史勁松教授。
角蛋白酶以其獨特而高效的水解能力在角蛋白廢棄物的生物降解和回收利用中顯示出重要的意義和應用潛力。在之前的研究中，作者從短小芽孢桿菌 (KerBp) 中挖掘出具有羽毛降解能力的角蛋白酶基因，然後在枯草芽孢桿菌中表達和工程化以實現其高效生產。利用角蛋白酶 KerBp，實現了羊毛廢料向自組裝角蛋白的轉化，同時保持了角蛋白優異的相容性和抗氧化性。然而，KerBp 較差的熱穩定性阻礙了其工業應用。在這項工作中，作者使用組合方法（基於計算機輔助分析和預測設計高柔性環區、鈣離子結合環區和非一致性氨基酸（圖1））來提高 KerBp 的熱穩定性的策略。這項工作不僅將開發一種具有處理角蛋白廢物潛力的改進角蛋白酶，而且還將在生物資訊學分析的幫助下設計酶熱穩定性工程的一般策略。本研究將為角蛋白酶在環境保護和飼料生產中的應用奠定堅實的基礎。
（1）角蛋白酶KerBp的高柔性環區分析及突變
高度靈活的環結構是酶催化功能的重要基礎，但通常也對熱敏感。因此，柔性環上的氨基酸已成為設計酶穩定性的熱點。在該研究中，作者採用 IUPred2A 和 FoldUnfold 來預測角蛋白酶 KerBp 的高度靈活的無序區域（圖 2a）。並透過同源序列比對結果與預測結果相結合並進行結構視覺化最終確定了3個區域：158-171、265-272和290-305。這些區域都是遠離活性中心的長loop，具有很大的靈活性。
為了進一步靶向修飾位點，分析了構成柔性環的氨基酸。進一步使用 B 因子和RMSF值來快速識別關鍵的氨基酸殘基（圖 3a）。綜合考慮B因子和RMSF值，將不同氨基酸的靈活性分為三類（0,1,2），B因子和RMSF值高的2類共22個氨基酸殘基被選為突變位點。針對選定的22個殘基的每個位點，根據MUpro計算的ΔΔG值構建並篩選虛擬飽和突變體庫。結果共產生了41個突變體。
對這些突變體進行活性和熱穩定性篩選進行了評估（圖 4）。其中，突變體 A165E 和 Q170T 將 KerBp 在 60°C 下的半衰期分別從 17.3 min 增加到 28.9 min 和 38.5 min，並很好地保留了它們的角蛋白酶活性。對於突變體 N292F，活性得到改善，60 °C 下的半衰期從 17.3 分鐘增加到 37.5 分鐘。分子間力分析表明突變體Q170T與Asp205之間形成了更短更強的氫鍵，推測這是提高熱穩定性的主要原因（圖5）。同樣，對於突變體A165E，Glu165與Ile143和Asn164之間的氫鍵更短，作用力更強，可以更好地保持蛋白質的穩定性。相關研究表明，分子間氫鍵的形成或加強是提高蛋白質穩定性的有效策略。
（2）Ca2+結合相關環的鑑定和突變
鈣離子結合區對於維持結構穩定性具有重要意義，針對Ca2+結合環的修飾可以有效提高酶的熱穩定性。對於角蛋白酶 KerBp，利用IonCom 預測了與 Ca2+結合相關的 37 個潛在氨基酸殘基，並根據 3D 同源結構將它們在空間上分為 4 組。Group1 是一個保守的 Ca2+結合區 (CaI)，由氨基酸 D149、L183、D184、N185、T186、I187、G188、V189 和 L190 組成。對CaI的進一步分析表明，保守氨基酸D149、L183、I187和V189與Ca2+直接配位，而構成洞穴狀環結構的其他殘基，包括D184、T186、G188和L190，起結構支撐作用（圖 6a）。對非保守殘基進行突變，以增強與Ca2+的結合能力，更好地保持結構的穩定性。
據報道，當 Ca2+與含有醯胺基團的谷氨醯胺 (Gln) 和天冬醯胺 (Asn) 和含有羧基的天冬氨酸 (Asp) 配位時，構型最穩定。因此，疏水性氨基酸G188分別突變為谷氨醯胺、天冬醯胺和天冬氨酸，L190突變為谷氨醯胺。突變體 G188N 和 G188Q 顯示出改善的熱穩定性，但僅保留了不到 50% 的酶活性。而突變體 L190Q 同時改善了這兩種特性，並且在 60°C 下的半衰期增加到 28.3 分鐘。推測突變體G188N和G188Q可能透過加強與Ca2+的相互作用來提高熱穩定性，但阻礙酶的活化。對於突變體L190Q，它位於Ca2+結合口袋的入口處，突變擴大了側角，可能促進鈣釋放和酶啟用（圖6e）。
（3） 基於殘基一致性進行熱穩定性改進
許多研究表明與非保守氨基酸相比，一致性氨基酸通常對酶的熱穩定性的貢獻更大。因此，非一致性氨基酸的替代已被用作提高蛋白質熱穩定性的可行方法。透過Consensus Finder程式的同源序列比對分析了KerBp每個位點的氨基酸頻率。選擇氨基酸頻率低於 10% 且具有高度保守殘基的位點進行突變。故總共選擇了 20 個氨基酸殘基進行突變（圖 7a）。結果表明突變體H92N和S171G在50°C和60°C下表現出更好的穩定性，且S171G的表達量和活性較野生型明顯提高。
（4）累積有益突變以產生協同效應
上述研究確定了6個突變體A165E、Q170T、N292F、L190Q、H92N和S171G，它們提高了角蛋白酶KerBp的熱穩定性，同時很好地保留了酶活性。它們分別位於高度靈活的loop158-171、loop290-305、Ca2+結合區和酶蛋白表面。單個區域或位點的突變具有一定的侷限性，因此，在這些位點進行組合突變，以進一步提高角蛋白酶的熱穩定性，以達到協同效應。如圖 8a 所示，對於突變體 A165E/Q170T/N292F、A165E/Q170T/N292F/L190Q、A165E/Q170T/N292F/L190Q/H92N 和 A165E/Q170T/N292F/L190Q/H92N/S171G，60°C 下的半衰期分別從 17.3 分鐘增加到 38.5 分鐘、48.9 分鐘、50.7 分鐘和 66.1 分鐘。對於具有 4、5 和 6 個位點積累的突變體，最佳反應溫度從 40 °C 提高到 60 °C。這些結果對於角蛋白酶在提高高溫條件下角蛋白降解效率和維持角蛋白酶活性方面的工業應用具有重要意義。
最後，角蛋白酶KerBp 和顯性突變體都表現出降解雞毛的能力。突變角蛋白酶可以實現約 66% 的羽毛降解，大約是野生型 KerBp 的兩倍（圖 8b）。
總之，在這項工作中，獲得了具有增強的熱穩定性的角蛋白酶變體，其對羽毛廢料表現出更好的降解能力，在環境保護和飼料生產等領域具有廣闊的前景。
整理：廖敏
DOI:10.1016/j.scitotenv.2021.151824
END
