光纖記錄詳解，一文帶你詳細瞭解光纖記錄實驗

一、光纖記錄工作原理

人類的大腦擁有約900億個神經元，神經元之間透過突觸相互連線形成了複雜的神經網路，並由此產生各種複雜的功能。大腦能夠合成和釋放上百種神經遞質，神經訊號透過突觸釋放的神經遞質從而在神經元之間進行傳遞（圖1）。

圖1

當神經興奮傳導到突觸末端時，會刺激突觸上鈣離子通道開啟促使鈣離子大量內流，胞內鈣離子濃度瞬時上升，驅動突觸小泡將神經遞質釋放到突觸間隙中，釋放出的神經遞質隨即與突觸後膜上的受體結合，將遞質訊號傳遞給下一個神經元，從而進行資訊的逐級傳遞（圖2）。這些神經元以複雜的通路投射到多個腦區，產生了學習認知、情感、控制、動機、獎勵等豐富的功能。光纖記錄系統則可以透過檢測鈣離子和神經遞質的熒光變化程度來表徵群體神經元的活動情況。

圖2

那麼光纖記錄是如何檢測神經活動的呢？

以鈣離子熒光訊號檢測為例，光纖記錄系統的技術原理是藉助鈣離子濃度變化與神經元活動之間的嚴格對應關係，利用特殊的熒光染料或者蛋白質熒光探針，將神經元中鈣離子的濃度透過熒光強度表現出來，並被光纖記錄系統捕捉，從而達到檢測神經元活動的目的。

在神經系統中，靜息狀態時神經元胞內鈣離子濃度為50-100nM，而在神經元興奮時胞內鈣離子濃度能上升10-100倍，因此我們可以透過注射鈣離子基因編碼指示劑（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）來標記鈣離子。鈣離子指示劑帶有熒光蛋白（如GFP、RFP等）及其變異體的蛋白質，可與鈣調蛋白（CaM）和肌球蛋白輕鏈激酶M13域結合（圖3左）。當神經活動增強時鈣離子通道開啟，大量鈣離子內流並與CaM結合，導致M13和CaM結構域相互作用，引發cpEGFP結構重排，從而增強綠色熒光訊號（圖3 右）。

因此我們可以透過檢測鈣訊號的變化來表徵神經元的活動，進而研究神經元活動與動物行為的相關性，探究複雜行為背後的調控機制。

圖3

(Marisela Morales, et al. Neuron, 2020)

圖4：VTA-VGluT2神經元編碼先天逃避反應

光纖記錄檢測神經遞質訊號的原理與上述方法相同，把cpEGFP嵌入特定的神經遞質受體，受體與神經遞質結合後會引發受體構象改變併發出熒光訊號（圖5）。透過病毒注射、轉染等技術手段，可以將這種可遺傳編碼的探針表達在細胞或小鼠腦部，藉助成像技術，觀察神經遞質濃度的實時變化。

圖5

(Yulong Li, et al. Cell, 2018)

圖6：條件反射實驗中伏隔核Nac腦區的DA釋放

二、光纖記錄實驗方法

在光纖記錄實驗中，首先要選擇合適的熒光病毒。熒光染料或指示劑是透過病毒載體轉入目標腦區，常用載體為AAV病毒。根據實驗的不同，需要選擇特異啟動子或者Cre-FloxP系統來特異標記目標神經元，無特異性的GCaMPs表達雖然可以觀測群體神經元活動但無神經元特異性，光纖記錄的作用在於觀測特異型別神經元群體的活動。

實驗流程：

1、在目標腦區注射鈣熒光病毒，並在注射位點埋植光纖插針，用於收集熒光；

圖7：病毒注射與陶瓷插針埋植

2、待2-3周鈣熒光病毒表達後，連線光纖，使用光纖記錄系統採集動物在行為學實驗中大腦的鈣熒光訊號；

圖8：病毒表達

3、透過分析軟體處理鈣熒光訊號資料，並結合行為學影片對動物的行為進行分析。

圖9：光纖記錄結合高架十字迷宮實驗

三、光纖記錄資料分析

以瑞沃德R820三色光纖記錄系統記錄的資料為例。

1、資料預處理。R820三色光纖記錄系統軟體集訊號採集與資料分析於一體，在資料分析中，資料預處理過程包含平滑處理，基線矯正，運動矯正等功能。

平滑處理可以將資料中的過多雜訊號去除，最大限度的突出目標peak。基線矯正多數針對的是熒光訊號因長時間記錄導致漂白訊號逐步下降，或者光纖的自發熒光在長期記錄下逐步被漂白基線逐步下降等情況。此情形的資料因為整體呈現下降趨勢，不利於後續資料作圖分析，所以需要進行基線矯正。運動矯正用於採用410nm對照通道的資料，410nm資料可以用於反應背景噪音訊號，運動矯正即將410nm資料與470nm資料進行擬合，透過演算法從470資料中去除410nm資料的波動，得到真實的熒光資料。