引言
我們實驗室有句話口口相傳：做上 WB，走上不歸路。WB 難，磷酸化蛋白的 WB 就更難了。做為在磷酸化蛋白上摸爬滾打多年的老司機，總結了一些經驗，希望能助各位科研民工們一臂之力，少走彎路，早日出結果發 paper，迎娶白富美，走向人生巔峰！！！
（文末開學豪禮等著你）
Q1: 什麼是蛋白質磷酸化？
磷酸化是將磷酸基團加在中間代謝產物上或加在蛋白質上的過程。
Q2: 蛋白質磷酸化的作用？
蛋白質磷酸化對於許多生物現象的引發是很必要的，包括細胞生長、增殖、泛素介導的蛋白降解等過程。細胞訊號轉導活動都是由一系列蛋白傳遞鏈構成的，訊號傳導的過程中涉及到多種蛋白質的可逆磷酸化過程。蛋白質透過可逆磷酸化，以及不同的級聯反應，可以將訊號放大傳遞等。由此可見蛋白質磷酸化在細胞訊號傳導過程中擔負著重要的作用。
Q3: 檢測蛋白質是否磷酸化以及磷酸化水平的常用方法？
Western blot 是評估蛋白磷酸化狀態的最常用方法，利用 SDS-PAGE 分離蛋白樣品，隨後轉移到印跡膜上，之後利用磷酸化特異性抗體來鑑定目的蛋白。
有人會說 western blot 還不好做嗎？那可是研究生的技能標配，但是磷酸化蛋白的 western blot 就不能小看了，多少人在這裡摸爬滾打，絞盡腦汁。下面重點來了，趕緊搬個小板凳認真學起來。
想跑出好的磷酸化蛋白條帶，與做普通的 Western Blot 相比，磷酸化 Western Blot 有一些要額外需要注意的事項：
01 檢測樣本是否表達目的蛋白
實驗前需先查閱文獻或透過預實驗檢測該樣本是否表達目的磷酸化蛋白，若正常情況下樣本的磷酸化水平過低或不表達，可透過物理或化學方法進行一定的刺激和誘導，正確的刺激會幫助得到最佳實驗結果。
02 檢測總蛋白是否有變化
封檢測磷酸化蛋白之外，往往也需要檢測總蛋白。僅僅是檢測到磷酸化蛋白表達量的升高或降低並不能說明問題，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值增加或減少了才能說明磷酸化水平的變化。
03 點樣時加入 Marker
做磷酸化蛋白 Western blot 時，除了目標蛋白的條帶以外，往往會出現非特異性的條帶。如果磷酸化抗體不佳，甚至只有非特異性的條帶，而沒有目的條帶。所以點樣時需同時加入合適分子量範圍的 Marker，根據 Marker 進行比對，檢視條帶的分子量，是否是目的條帶。否則有可能會誤以為一些非特異條帶是目的帶，白白耗費了大量精力得出錯誤的結果。
04 抑制磷酸酶的干擾
由於蛋白的磷酸化是可逆的，會被磷酸酶去磷酸化，所以在樣品製備和整個檢測過程中，需要抑制或避免細胞內源性和外源性的磷酸酶的干擾。針對細胞內源性的磷酸酶，在樣品製備時，需要在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑。外源性的磷酸酶主要是由實驗過程中的其它試劑帶入的，比如要確保實驗試劑中不含磷酸酶等；此外，樣品中或其它試劑中帶的細菌也會分泌外源性的磷酸酶，所以另一個關鍵是要儘量使用無菌清潔的試劑和凝膠，必要時加入防腐劑。
所謂細節決定成敗，除了以上注意事項，操作細節尤其重要，稍不注意就會事倍功半，這就是為什麼很多小夥伴在做磷酸化蛋白的 WB 實驗時，很疑惑明明按照步驟操作的，為什麼結果還是不理想，所以大家一定要注意以下細節。
Tips 1：蛋白提取
1
提取蛋白樣品的過程要迅速，樣品要新鮮，最好在冰上操作，操作時間儘量短。
2
用 PBS 洗滌細胞時，一定要 4℃ 預冷。如果是組織的話，提取蛋白時採用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前預冷，保持低溫狀態。
3
提取的磷酸化蛋白蛋白定量後馬上變性並於 -80℃ 分裝儲存，以保證降解程度最小，避免反覆凍溶導致磷酸基團的降解。
4
磷酸化蛋白容易脫磷酸化，除提取蛋白時要迅速小心外，也可在上樣緩衝液和轉移緩衝液中加入磷酸化酶抑制劑 Na3VO4 等。
Tips 2：封閉
1
避免印跡封閉時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結合。
2
封閉後在 TBST 中洗滌 5 分鐘。
3
一抗和二抗均建議用 1*TBST 洗印跡 3 次，每次 5-10min。洗印跡時間不宜過長或過短，過長會導致訊號減弱（抗體被洗脫），過短則會導致背景深。洗膜時不要把幾張膜疊在一起洗，否則會影響洗膜效果。
Tips 3：抗體
1
選擇好的磷酸化抗體是成功的關鍵因素。且儘量根據磷酸化抗體公司的 protocol 來操作實驗，這是實驗成功的保證。
2
抗體的稀釋倍數也要適當，可依據實驗結果最佳化調整。 孵育磷酸化抗體即一抗後建議 4℃ 過夜，保證抗體有充分的結合時間，因為通常磷酸化的蛋白只佔總的蛋白量的極少部分。
3
二抗孵育室溫 1 小時即可。
3
Tips4:曝光
1
磷酸化蛋白檢測時背景往往比較深，所以曝光或壓片時間要適當，不能太長或過短，太長則背景太深蓋住了目的條帶，時間過短則可能沒有條帶或者條帶太淺。可以選擇多個時間進行曝光或壓片，選擇最佳結果，再優化出適合自己目的蛋白和實驗體系的最佳條件。
2
一般磷酸化和總蛋白的條帶位置基本是一樣的，所以可以在顯影完磷酸化抗體後，將印跡上已結合的抗體剝離後再孵育總蛋白抗體（需重新封閉）顯影。
3
Strip 時一定要注意，印跡膜一定要完全浸泡在含剝離液的容器中，置於 40-50℃ 恆溫箱中，使受熱均勻，搖床孵育 30 分鐘。抗體剝離液是用來去除已結合的抗體，如果溫度過高或時間太長但也會去除部分的蛋白，導致蛋白訊號變弱。
只要按照以上注意事項操作，小白也會成為實驗小達人，做出理想的磷酸化蛋白條帶。最後向還在跑 Western 的同學們致敬，條帶會有的，文章會有的，開學豪禮也會有的
一樣的開學季，不一樣的開學禮
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