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大家好呀！今天給大家介紹一篇2022年1月發表在Cancer Cell（IF:31.743）上的文章。作者對77例接受抗PD-1和抗CTLA-4治療的晚期面板黑色素瘤患者的全基因組資料，轉錄組資料和甲基化資料進行分析。結果表明TMB，新抗原負荷，IFNγ相關基因表達程式性死亡配體表達，PSMB8低甲基化和T細胞與免疫治療反應有關。結合TMB和IFNγ相關基因表達水平構建的模型可以準確預測免疫治療反應。高TMB和高IFNγ特徵對免疫治療反應最好。
Multiomic profiling of checkpoint inhibitor-treated melanoma: Identifying predictors of response and resistance, and markers of biological discordance
檢查點抑制劑治療黑色素瘤的多組學分析：鑑定預測反應和抵抗的標誌物和生物紊亂標誌物
流程圖：
結果：
1.接受抗PD-1免疫治療的黑色素瘤患者的臨床特徵
作者收集抗PD-1免疫治療的77例黑色素瘤患者的樣本，包括單獨PD1和PD1聯合IPI治療。免疫治療中位時間為5.2個月，腫瘤組織主要來自皮下和區域淋巴結。77例患者中有66例患者發生於非肢端面板部位，11例發生隱匿性原發性黑色素瘤（表1）。年齡中位數為58，51例為男性。
表1 患者臨床特徵
2.高TMB,低結構變異負荷和高新抗原負荷與反應較好有關
作者首先研究了每個樣本的SNV，SV和CNA與免疫治療反應的關係（圖1A）。高TMB與免疫治療反應顯著相關（圖1B）。高SV和高CNA與免疫反應較差有關（圖1C和1D）。當根據免疫治療型別進行分類時，PD1治療反應與TMB顯著相關而IPI+PD1治療反應與SV顯著相關。高TMB和低SV與免疫治療的PFS改善顯著相關。此外，TMB與新抗原負荷具有良好相關性，新抗原負荷較高時反映較好（圖1E和1F）。
圖1 體細胞變異和新抗原表達與免疫治療反應的相關性
3.基因突變與免疫治療反應和抗性無關
接下來，作者研究免疫治療反應是否與特定的基因突變有關。作者發現TCGA分子亞型與免疫治療反應無關（圖1A）。作者對SNV和Indel進行分析然而並沒有發現具有統計學意義的基因。此外，作者還在對已有報道與反應有關的基因中尋找特定突變，然而與反應較好或較差沒有相關性。
4.干擾素和T細胞受體訊號通路富集於免疫治療反應組，但沒有特徵與反應不良組有關
對53例樣本進行RNAseq，對反應良好組和反應不良組進行差異分析鑑定到205個DEGs。在反應良好組中大量免疫基因（CD274,STAT1,IFNγ,GZMA,PRF1,GZMB和CD8A等）上調錶達。富集分析表明，反應良好組中只有IFNγ反應通路顯著富集（圖2A）。
對43個樣本進行Illumina EPIC甲基化測序，差異分析僅鑑定到5個差異甲基化CpG位點。由於這5個CpG位點均不在基因啟動子區域，作者接下來重點關注205個DEGs的甲基化水平。有5647個CpG位點註釋到192個差異基因中，173個基因中有1671個CpG位點與表達顯著相關，在41個基因中有5個或更多的CpG位點與表達呈負相關。其中，PSMB8的CpG位點與表達負相關，且在反應良好和反應不良之間具有顯著差異。
接下來，作者分析了與免疫治療反應有關的基因的表達水平。有一部分基因在反應良好和反應不良中差異表達（圖2B）。還有一些特徵在反應良好和反應不良中具有顯著差異，包括6-基因IFNγ特徵（圖2C），18-基因IFNγ特徵（圖2D），效應T細胞特徵（圖2E），結合IFNγ/效應T細胞特徵（圖2F），趨化因子特徵（圖2G）和TIDE特徵（圖2H）。
圖2 黑色素瘤的差異表達基因
5.CD8 T細胞，M1巨噬細胞和細胞溶解活性對應答者免疫微環境的影響
作者使用CIBERSORT評價免疫細胞浸潤水平，鑑定反應良好和反應不良組的浸潤水平具有顯著差異的細胞型別（圖3A）。其中反應良好組中M1巨噬細胞和CD8 T細胞浸潤水平較高（圖3B和3C）。使用methylCibersort的甲基化水平評估免疫細胞浸潤水平，CD8 T細胞在反應良好組中浸潤水平較高（圖3D）。基於PRF1和GZMA的表達水平評估細胞溶解活性，細胞溶解活性在CD8 T細胞啟用時上調，在反應良好組同樣上調（圖3E）。PRF1和GZMA的低甲基化與反應良好有關（圖3F）。免疫組化分析表明CD8 T細胞與反應良好有關（圖3G），瘤內CD8 細胞表達增加（圖3H）。此外，PD-L1表達水平在反應良好組中較高（圖3J）。
圖3 黑色素瘤的腫瘤免疫微環境
6.TMB和IFNγ-6打分可以預測免疫治療反應
由於TMB,IFNγ-6和CD8 T細胞與免疫治療反應有關，因此作者認為高TMB與免疫應答高有關，作者接下來研究TMB與IFNγ-6和CD8 T細胞的相關性。對53例樣本構建預測免疫治療反應的迴歸模型。首先，作者基於TMB，SV，腫瘤純度和特徵基因表達水平等構建單因素模型，其中TMB的作用最強。接下來，作者使用TMB和其他因子依次構建多因素模型。TMB結合IFNγ或TMB結合T細胞特徵的模型具有相似的預測效能。TMB，IFNγ或TMB結合IFNγ的模型的ROC曲線如圖4A和5A所示。因此，TMB高和IFNγ-6高的患者對免疫治療反應較好（圖4B）且OS較長（圖4C）。接下來，作者使用一個包括60例黑色素瘤患者的獨立資料集來驗證TMB和IFNγ-6的效能，ROC曲線如圖4D和5B所示。
圖4 TMB和IFNγ相關基因表達預測免疫治療反應和PFS
7.分析腫瘤中的生物學紊亂
對TMB/IFNγ-6模型不能準確分類的12例樣本，進行臨床和分子檢測可以深入瞭解潛在的耐藥性機制和預測耐藥性反應（圖5A和5C）。12例樣本中有7例接受了PD1治療與可以準確預測的患者沒有相同的分子特徵（圖5C）。第8例樣本具有潛在的耐藥生物學機制（JAK3突變）。8個樣本中有4個的TMB高且IFNγ-6低，4個的TMB低且IFNγ-6高。
圖5 單因素和多因素的二元變數分佈
結論：
作者對77例黑色素瘤患者的轉錄組資料，全基因組資料和DNA甲基化資料進行分析，鑑定與免疫治療反應顯著相關的生物標誌物。結果表明，TMB,IFNγ-6和CD8 T細胞與免疫治療反應顯著相關。此外，結合TMB和IFNγ-6構建模型可以準確預測患者的免疫治療反應和總生存期。本篇文章的亮點在於：第一，作者的樣本是自己收集的樣本而不是和常規生信分析一樣的TCGA資料集；第二，作者的分析資料為多組學資料。如果你手裡也有自測資料的話，不妨學習一下這篇文章的研究思路，說不定下一篇高分文章就是你的~~
