樹木的木材形成是一個複雜而昂貴的發育過程，木材的形成受到分層轉錄因子網路 (HTFN) 的精細控制，該網路在擬南芥和樹木之間相對保守。PtrPAL2和Ptr4CL3表達的轉錄調控在木質素生物合成過程中得到了實驗證明。目前，尚不清楚Ptr PAL2 和 LTF1/ Pd MYB4 這兩種木質素相關蛋白如何在木質細胞中受到精確調控。
2022 x年 1 月 14 日青島農業大學研究團隊在frontiers in plant science發表了一篇名為
“A High-Throughput Screening System for Populus Wood-Associated Transcription Factors and Its Application to Lignin Regulation”的文章對全基因組分析揭示了 楊樹木材相關轉錄因子高通量篩選系統及其在木質素調控中的應用。
為了在轉錄水平了解木材形成的調控機制，我們在此生成了一個與木材相關的 Gal4-AD-TF 庫，其中包含來自快速生長的樹種楊樹的 517 個 TF。使用兩個木質素相關基因（ PaPAL2和LTF1/PaMYB4）作為誘餌，應用高通量 Y1H 和 Y2H 篩選來驗證該文庫的效率。
PaPAL2是楊樹中擬南芥PAL1的直系同源物，是一種限速酶，在木本細胞的單木酚生物合成過程中控制苯丙烷脫氨基生成肉桂酸。此外，PaPAL2是 Pa MYB21 的直接靶標，Pa MYB21 是木材形成的第二層主調節劑。因此，選擇PaPAL2來測試該酵母文庫的效率並闡明木質素生物合成途徑。
圖 2.與PaPAL2啟動子結合的 TF 的鑑定
表 1.使用Y1H在楊木相關文庫中鑑定的與PaPAL2啟動子結合的轉錄因子
Pa MYB21、Pa DF1、Pa MYBH 和Pa WRKY20與PaPAL2一樣，在木質化木質部中表現出高表達，並透過 Y1H 方法選擇它們進行驗證。EMSA 結果顯示，Pa DF1、Pa MYBH 和Pa WRKY20 蛋白能夠在體外特異性結合PaPAL2啟動子的這些順式元件（圖 2D-F）。
LTF1/ Pa MYB4 是木材形成過程中木質素生物合成的關鍵負調控因子。為了闡明木質素生物合成的調控機制，我們透過與誘餌 LTF1/ Pa MYB4交配，在我們的 TF 文庫中篩選了 LTF1/ Pa MYB4 相互作用蛋白。獲得了十個 TF 克隆（圖 3A，B）。其中三個屬於 Trihelix 家族，三個屬於 GRAS 家族，一個屬於 MYB、NAC、WRKY 或 SBP 家族（表 2）。有趣的是，這些 TF 包括Pa MYB21、Pa DF1 和Pa WRKY20，它們被證明直接調節PaPAL2表示式（圖 2）。對高空間解析度木材轉錄組譜的分析揭示了 LTF1/ Pa MYB4 及其 10 種相互作用蛋白在木材形成組織（如次生韌皮部和木質化木質部）中的高表達（補充圖 1B）。
圖 3.識別與Pa MYB4/LTF1 相互作用的 TF
表 2.使用Y2H在楊木相關文庫中鑑定的與Pa MYB4/LTF1相互作用的轉錄因子
選擇了五個 TF（Pa MYB21、Pa DF1、Pa GRAS2、Pa WRKY20 和Pa ANAC83）以使用 Y2H 驗證它們與Pa MYB4 的相互作用（圖 3C）。用 TF-BD 和Pa MYB4-AD轉化的酵母細胞在 SD/-Leu-Trp-His-Ade 平板上呈現藍色，證實了五種 TF 與 LTF1/ Pa MYB4 之間的相互作用。
在高通量 Y1H/Y2H 篩選系統的幫助下，我們在楊樹中鑑定了 5 個與 PaPAL2 啟動子片段結合的TF和10 個與Pa MYB4相互作用的 TF ，表明我們的文庫效率很高。5 個 TF 與PaPAL2的啟動子片段之間以及 10 個 TF 與 LTF1/ Pa MYB4 之間的相互作用為如何精確控制木質素生物合成提供了線索。我們的高通量 Y1H/Y2H 篩選系統是幫助剖析樹木中木材形成的轉錄調控網路的強大工具。
