1975年，Porath 及其同事發表了一篇題為“Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation”的文章，該方法基於蛋白質親和力的差異，將金屬離子和亞氨基二乙酸(IDA)以1：1的比例固定在瓊脂糖基質上，成功實現了蛋白質的分離。Porath提議將該方法稱為Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC)。
圖1. IMAC的結構示意圖
重組技術和分子生物學的快速發展有效地推動了IMAC的應用。透過對DNA模板上的目標分子進行修飾，表達帶有寡聚組氨酸（His標籤，常用6個His）的重組蛋白。這種重組蛋白純化方法成為IMAC的重要應用，大家較為熟知的就是用固定了鎳離子的填料純化帶His標籤的蛋白。其原理是鎳離子與組氨酸側鏈上的基團透過配位鍵發生結合。
圖2. His標籤與三種IMAC配位方式中的金屬離子相互作用的模式
鎳離子共有六個配位鍵，首先層析介質需要佔用幾個配位鍵將鎳離子螯合在填料上，常見的螯合方式有三種：三價、四價和五價配位 ，即填料上的螯合劑分別佔用三個、四個和五個配位鍵。佔用的配位鍵數量越多，鎳離子將被固定得越牢固，鎳離子的脫落也將更低。因此對於一些分泌到真核細胞培養基中的His標籤蛋白，我們推薦使用五價配位的填料進行純化，例如Cytiva Ni Excel填料，它能耐受培養基中高濃度的螯合劑如EDTA等，有效降低了鎳離子發生脫落的風險。但是由於其五價配位的形式僅保留了一個可以結合目標蛋白的配位鍵，所以五價配位的劣勢是其蛋白的結合載量（10 mg/mL）及結合強度明顯低於另外兩種方式。四價配位中的鎳離子相對三價配位要牢固的多，且兩者載量相差不大（40 mg/mL)。所以對於普通大腸桿菌體系表達的蛋白，一般推薦四價配位的產品，例如 Cytiva 的Ni Sepharose FF或HP填料。
在瞭解了配位方式以後需要確認一種金屬離子進行純化。一般來講，三價陽離子，如Al3+、Ga3+、Fe3+或者四價陽離子Zr4+更適合捕獲磷酸化蛋白質和磷酸化多肽。二價金屬離子，Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+常用於His標籤蛋白的純化。
鈷離子Co2+具有和鎳離子Ni2+相似的配位結構，鈷離子的離子半徑較大，對於標籤蛋白的親和力更低。當鎳離子純化有較多的非特異性雜帶的時候，可以嘗試鈷離子，如Cytiva的Talon系列產品。
銅離子Cu2+對於His標籤的親和力較高，若組氨酸的數量較多則不建議使用銅離子，易出現目標分子不能充分洗脫的情況。當組氨酸數量較少或對於含有色氨酸而不含組氨酸的樣品可以嘗試銅離子。銅離子對於很多蛋白的結構和功能有影響，因此選擇銅離子時要慎重。
鋅離子Zn2+的親和力一般比較弱。鋅指結構蛋白純化時經常會發生一個有趣的現象，如果用鎳柱純化鋅指蛋白，填料上的鎳離子會和鋅指中的鋅離子發生交換。鋅指蛋白作為一類蛋白超家族，僅C2H2鋅指轉錄因子就有幾百種，在這類蛋白質中，每個指狀結構均為兩個半胱氨酸和兩個組氨酸殘基與鋅離子配位形成空間構象。如果採用IMAC純化C2H2鋅指蛋白，可以選擇固定鋅離子的IMAC介質，這樣可以獲得完整且均質的目標分子。
表1. 部分IMAC應用案例
IMAC具有以下幾個特點：
1
可以結合充分暴露出來的組氨酸、色氨酸、半胱氨酸的側鏈基團。
2
可透過加入一定濃度的鹽來抑制金屬離子的離子吸附作用。
3
結合過程受pH的影響，對於大部分蛋白樣品，低pH容易導致目標分子的解離。
4
有多種洗脫技術可供選擇（pH梯度、競爭性洗脫、螯合劑等）
