I型膠原α1鏈基因是豬基因組中的一個可選的友好基因座

外源基因在轉基因動物和細胞中穩定、高效的表達，對於基因功能的研究和生物反應器的建立至關重要。動物基因組中的友好基因座能使外源基因高效穩定的表達且無副作用，但目前豬基因組中可供外源基因安全、高效定點整合的基因座相對較少，限制了多轉基因豬的研究和發展。

本研究提出了一種將豬I型膠原α1鏈（collagen type I alpha 1 chain，COL1A1）基因座作為友好基因座表達外源基因的新策略。利用CRISPOR軟體設計了一對靶向COL1A1基因終止密碼子的sgRNA，並連線到CRISPR/Cas9表達載體pX330中；同時合成了一個不含啟動子、左右同源臂各長為900 bp的2A-GFP供體載體，然後共轉染豬腎上皮細胞（porcine kidney epithelial，PK15)，胎兒成纖維細胞（porcine embryonic fibroblast，PEF）以及迴腸上皮細胞（porcine intestinal epithelial，IPI-2I）3種細胞。電轉染48 h後觀察3種細胞的熒光情況，72 h後透過流式細胞術分選綠色熒光蛋白陽性的細胞，並透過熒光定量、蛋白質印記、轉錄組測序和CCK8實驗在不同水平上評估COL1A1基因作為豬基因組外源基因定點整合位點的安全性。
結果表明，共轉染sgRNA和供體載體之後，可以分別在豬3種不同細胞中觀察到綠色熒光，說明同源重組介導的定點整合系統可以在豬基因組中很好的發揮作用。qPCR結果顯示，GFP敲入對3種細胞COL1A1基因mRNA的表達並無顯著影響（PK15、PEF和IPI-2I細胞中的P值分別為0.29、0.66和0.20）。同樣，蛋白質印記結果顯示，GFP陽性細胞與野生型細胞COL1A1蛋白的表達並無顯著差異（PK15、PEF和IPI-2I細胞中的P值分別為0.64、0.48和0.80)。轉錄組測序結果顯示，GFP陽性PEF細胞與野生型PEF細胞的轉錄組顯著正相關（P<2.2e-16），表明GFP敲入沒有改變內源性基因的整體表達。CCK8實驗表明，GFP敲入對PK15細胞增殖並無顯著影響（24 h，48 h，72 h，96 h，120 h的P值分別為0.31，0.96，0.24，0.17和0.38）。

上述結果表明，COL1A1基因可作為豬基因組中外源基因定點整合的友好基因座，可廣泛應用於家畜育種和生物醫學模型的建立。本研究首次鑑定出了COL1A1基因可以作為豬基因組中的友好基因座。

文章連結https://www.chinaagrisci.com/Jwk_zgnykxen/fileup/2095-3119/PDF/JIA-2021-1394.pdf
引用本文 >>XIANG Guang-ming, ZHANG Xiu-ling, XU Chang-jiang, FAN Zi-yao, XU Kui, WANG Nan, WANG Yue, CHE Jing-jing, XU Song-song, MU Yu-lian, LI Kui, LIU Zhi-guo. 2022. The collagen type I alpha 1 chain gene is an alternative safe harbor locus in the porcine genome. Journal of Integrative Agriculture, in press.