對照在任何實驗中都是非常重要的，對照設定的越充分我們的實驗結果可以解讀的就越精準。對照在流式細胞術中更是尤為重要，對照有將實驗結果和背景區分，排除非特異性的效應，獲得高質量的資料結果等作用。
1 空白/陰性對照：
即不新增任何額外熒光染色的對照管。設定空白對照用以區分細胞本底的自發熒光及判斷藥物等外界處理是否會使細胞額外引入自發熒光。除此之外還可以輔助進行補償的調節，及輔助調電壓即光電倍增管電壓增益，因為它代表的為可能存在的最負陰性總群體的位置，當然，最適的補償和電壓調節還要依賴於單染管及全染樣品管的分辨效果。另，空白對照通常不適用於界定染色樣品上的陽性門位置，因為它既不能代表其他熒光通道的洩露或外源刺激導致的本底總陰性群訊號的增強，也不能排除感興趣通道中抗體非特異性結合的實際情況。
2 單染/單陽對照：
即只染多色方案中其中一種熒光染色的對照管，單染對照管的數量等於多色方案設計中選擇的熒光數量。當進行多色流式實驗時，單染對照對於調節補償是至關重要的。單獨染色可顯示不同熒光團之間光譜重疊的水平，進而透過儀器上或者分析軟體上的補償調節來去除此重疊。當使用單個染色樣品進行補償時，要考慮的重要事項是熒光基團需要相同，其亮度儘量與實驗中使用的相似，確保有明顯的陰陽分割槽，無過多的假陽性訊號，且需要收集足夠的多的events數才能調節出最準確的補償值。樣本無法滿足以上需求時，可使用補償微球產品替代樣本進行補償的調節。
圖1 熒光單染校正光譜重疊：CD45RA FITC(MCA88)單染的淋巴細胞在PE通道中檢測到熒光(a)，但在正確補償後FITC熒光未溢漏到PE通道(b)。
3 同型對照：
即用待測樣本染了熒光抗體對應的同型抗體的對照管。在流式細胞術中，染色的背景水平是一個重要的影響因素，特別是在較為罕見的低表達或者連續表達的細胞建立多色模板時，需要設定同型對照。同種型對照的作用是消除由於抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體及靜電原因等結合而產生的背景染色，幫助確定圈門位置時，得到真實的目的細胞陽性率。這些對照與目標抗體具有完全一致的抗體來源，並且附著相同的熒光染料。在特定情況下，尤其是當單核細胞被用串聯染料如PE/Cy7、APC/Cy7、APC/Fire 750、APC-H7或PE-CF594等標記的抗體染色時，使用同型對照抗體是非常有幫助的。單核細胞傾向於與CY7、Fire 750和H7等染料非特異性結合。造商使用試劑配對同型抗體，專用緩衝液，使用人源抗體或敲除技術去除非特異性結合位點等技術，以減少這一背景。
圖3 使用死活染料去除死細胞可以改善染色：人外周血樣本：(a)僅使用前向側向散射圖圈出目標細胞，不能去除所有死細胞，非特異性結合仍然存在。(b)使用PI排除死細胞，顯示較少的非特異性結合，更容易分辨陽性染色群體。
4 死活對照：
樣品中死細胞的存在會極大地影響染色效果，從而影響資料質量。因為死細胞具有更大的自發熒光，而且會增加非特異性的抗體結合，導致假陽性並增加背景訊號從而降低陽性訊號的動態範圍，這可能會使弱陽性樣本和稀有群體的鑑定變得困難。另死細胞還無法刺激表達活化功能相關的標誌物，從而導致一些比真實陽性率偏低的假陰性結果產生。使用基於前向和側向散射的門可以幫助清除部分碎片和死細胞，但它無法將它們全部移除。 需要使用用於鑑定死細胞的活性染料，這些染料的型別包括表染可用的核酸類染料，例如PI，7-AAD等，以及表染和破膜樣本都可用的蛋白質結合染料如BD的FVS 系列染料。
圖3 使用死活染料去除死細胞可以改善染色：人外周血樣本：(a)僅使用前向側向散射圖圈出目標細胞，不能去除所有死細胞，非特異性結合仍然存在。(b)使用PI排除死細胞，顯示較少的非特異性結合，更容易分辨陽性染色群體。
5 FMO（Fluorescence Minus One）對照：
即熒光減一對照，設定示例見下圖4。在沒有圖2所示的情況下，高維流式細胞術中的主要背景訊號往往來自補償洩漏而不是非特異性結合。因此，在沒有其他非特異性染色的情況下，FMO對照在設定圈門時通常比同型對照更有參考意義。
圖4.使用FMO對照來確定其他熒光散佈及界定精確的陽性門位置。 第一張圖為空白對照；第二張圖是PE-Cy5的FMO對照，可以看到其它熒光素對該通道產生了散佈，使得陰性和陽性細胞群的界限發生了改變；第三張圖全染後分析樣本，按照黑色虛線精確設定陰陽性界限。
6同型和FMO對照組合：
即FMO與被去掉的抗體對應的同型對照抗體的“組合”對照。人們試圖結合FMO(考慮溢位)和同型控制(考慮非特異性結合)的好處。雖然這在理論上可能是“兩全其美”，但值得一提的是，使用此型別控制元件仍然存在一些缺點，這些缺點不能透過將其與FMO相結合來緩解。具體地說，特定的同型對照抗體可能具有或不具有與待測抗體相似的非特異性結合特性，並且它可能需要對同型對照進行滴定以更接近那些非特異性結合特性。
7 內部對照：
即實驗設計上的對照，如刺激前後，加藥處理前後，共培養前後等。對於細胞內細胞因子染色，最好的門控對照可能是內部對照（例，來自同一樣本的未刺激細胞）。如細胞內染色實驗涉及固定和破膜，這些步驟會影響抗原檢測，自發熒光，熒光素亮度和細胞形態。
8 生物學對照：
生物學對照即已知的結果為陰性或陽性的樣本對照。生物學對照對於所有染色都是重要的，尤其是對於具有更高背景熒光的細胞內染色更重要。從文獻中已知的表達或缺乏感興趣抗原表達的細胞，或使用RNAi或CRISPR等技術將抗原敲除的細胞產生陰性細胞，或已轉染的細胞並且抗原被過度表達以確保陽性染色的細胞。對於一些實驗，例如細胞活化實驗，未刺激，已報道過確認可以對樣本進行活化的刺激來和自己實驗中的刺激方案做對照，對於確定陽性結果和活化水平動態變化是很重要的。
