高通量基因組測序建立的關於人類腫瘤背後的基因改變圖譜，推動了癌症中“以突變為中心”的觀點，指導著目前精準醫療的治療方案。在這個背景之下，DNA改變成為了指導治療選擇的生物標誌物，而體外模型則被用於驗證突變關聯分析，增強了治療發現的效果【1,2】。
為了維持臨床轉化的相關性，體外模型反映體內特性的保真度至關重要。在“以突變為中心”的癌症觀點的推動下，模型保真度通常由基因組相似性來評估，然而，越來越多的證據表明，單獨使用突變來指導治療方法是有侷限性的。單細胞基因組技術的出現證實了人類腫瘤中廣泛的突變異質性，同時也從細胞轉錄狀態的可變性進一步揭示了癌症的複雜性。透過RNA表達測量的細胞狀態是腫瘤表型的一種複雜表現，因為它整合了來自細胞內在（如突變背景、表觀遺傳狀態）和細胞外在（如細胞間相互作用、組織結構來源）的資訊。細胞狀態和治療敏感性之間的關係代表了癌症治療發展的一個鮮為人知的新機遇【3】。
以胰腺導管腺癌（PDAC）為例，儘管PDAC具有廣泛的基因組特徵，大多數病例其實並不存在與治療相關的基因組特徵改變，但是從大量測量中獲得的RNA亞型（狀態）已經成為一種重要的臨床生物標誌物【4】。值得一提的是，雖然PDAC亞型研究在很大程度上再現了常見的表達特徵，但尚不清楚這些大量的RNA-seq狀態測量是否掩蓋了單細胞水平的異質性，也不清楚來自惡性細胞和非惡性細胞的特徵區別，以及它們在實驗室模型中的重現性如何。此外，PDAC腫瘤微環境（TME）包括許多非惡性免疫和基質細胞型別，但它們在不同疾病部位的變化及其對惡性細胞狀態和治療反應的影響也尚不清楚。因此，鑑於PDAC突變生物標誌物的缺乏，瞭解區域性TME如何影響細胞狀態，以及細胞狀態是否可作為治療選擇的有效生物標誌物仍然至關重要。
2021年12月9日，來自美國哈佛和麻省理工博德研究所的Alex K. Shalek團隊在Cell上線上發表題為Microenvironment drives cell state, plasticity, and drug response in pancreatic cancer 的文章，開發並採用最佳化的轉化工作流程，使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）對轉移性PDAC患者組織及匹配的類器官模型進行了高解析度分析，生成了轉移性PDAC的單細胞圖譜，並將其作為匹配的類器官模型中細胞中狀態的標準化參考，由此發現了一種新的中間共表達子（IC）PDAC細胞狀態，揭示了不同的位點和亞型特異性TME，並證明TME訊號是癌細胞狀態、可塑性和對治療反應的關鍵調節因子。
目前的精準醫學方法專注於評估模型的DNA保真度，而忽略了RNA狀態。因此，本文研究人員比較了原發和轉移性患者腫瘤與已建立的細胞系和新產生的患者源性類器官佇列的DNA和RNA測序譜，以瞭解每個模型系統如何代表突變和RNA表型在患者中的分佈。分析結果顯示，各組之間的驅動癌基因改變頻率沒有顯著差異，但是PDAC細胞系和類器官均不能完全顯示患者佇列中出現的全部表達亞型，提示體外模型系統保留了遺傳保真度，但失去了表達狀態異質性。這就迫切需要新的方法以用來識別體內和體外模型體系中癌細胞狀態的決定因素。為此，研究人員建立了一種方法，利用PDAC患者的核心穿刺活檢構建匹配的類器官，並對兩者進行匹配的scRNA-seq（圖1），從而獲得了高質量的惡性和非惡性單細胞轉錄組。
圖1
透過複製數變異（CNV）分析將PDAC細胞與非惡性細胞分離後，研究人員首先分析了之前描述的RNA亞型是否在轉移性PDAC單細胞中表達。結果顯示，轉移細胞亞群在來自獨立批次研究的經典樣或基礎樣特徵方面表達較高，表明這些表達程式與體內PDAC生物學的普遍相關性。而其餘的文獻來源的特徵在這些轉移細胞中表達較低，提示要麼是原發性疾病的特異性，要麼是大量RNA譜中非惡性表達的影響。有趣的是，有一大群細胞對所有先前提出的特徵都表現出低表達，這突出了我們對PDAC表達狀態的理解上的差距。進一步分析表明，並非所有具有基礎樣特徵的細胞都具有相同的潛在屬性，由此強調了利用scRNA-seq來了解惡性細胞如何感知和響應其區域性TME的重要性。
本文將來自單細胞佇列的特徵稱為單細胞基礎特徵（scBasal）和單細胞經典特徵（scClassical）。雖然一些研究表明基礎的和經典的程式僅存在於離散的細胞群中，但本研究發現scBasal和scClassical的程式並不是相互排斥的。相反，研究人員發現了介於scBasal和scClassical基因表達特徵之間的細胞，它們在不同程度上共同表達了這兩個程式的特徵。同時研究人員鑑定了115個表達與scBasal-scClassical共表達相關的基因，並將其命名為IC狀態。分析表明，雖然IC狀態可能並不代表發育軌跡上的一個明顯步驟，但它可能代表了癌症環境中類似的應激誘導的過渡狀態。惡性細胞狀態多樣性較高的樣本（即scBasal細胞和scClassical細胞比例較高）也表現出表達IC狀態的細胞比例較高，這表明IC狀態可能是scBasal細胞和scClassical細胞之間的過渡。進一步研究結果表明，轉移性和原發性PDAC中存在一個三重細胞狀態框架，在單細胞中跨越了基礎表型和經典表型，並具有相當大的共同表達的特徵。
隨後，研究人員分析了匹配的體外模型是否保留了其來源組織的細胞狀態分佈，研究結果表明微環境生長條件的改變顯著改變了細胞轉錄狀態，並誘導了培養特異性表達程式，由此也強調了利用匹配的體內狀態作為參考對體外模型進行標準化的重要性。無論原始活檢中的細胞狀態分佈如何，在培養過程中，單個模型都隨著時間的推移出現了更多的scClassical或類器官特異性細胞狀態。進一步探索這種細胞狀態偏差的驅動因素髮現，雖然與之前的大量研究結果一致，單細胞KRAS複製數增加與轉移細胞中的scBasal顯著相關，但是惡性細胞狀態從體內的scBasal轉換成了類器官培養中的scClassical狀態，由此表明單靠KRAS擴增不足以鎖定scBasal表達狀態，PDAC細胞是可塑的，在這種情況下，微環境可以獨立於基因型而影響細胞狀態。
深入的實驗發現，培養基配方會影響體外PDAC的轉錄狀態。在類器官培養中會出現某些基因的相對缺失，這些基因在體內轉錄亞型的表達差異表明，TME訊號在充分明確的癌細胞轉錄狀態和潛在的治療反應中發揮了作用，即使是已建立的模型也對培養條件的變化敏感，並且預先選擇壓力和培養基印記的組合形成了現存模型系統中的細胞狀態偏差，影響了它們的功能屬性。透過調節培養條件可以實現跨越純scClassical表達、異質性表達和純scBasal表達的成分差異，類似於在體內看到的那些。此外，實驗還發現，轉錄狀態可能是腫瘤對藥物反應的主要決定因素，而細胞狀態的差異靶向性代表了一種可操作的治療模式。新增TME訊號或改變培養基配方，可以透過改變轉錄狀態影響腫瘤模型對藥物的敏感性，這也凸顯了腫瘤模型本身的顯著表型和功能可塑性。
腫瘤細胞體內TME相關表達模式的存在提示轉移性TME可能存在亞型依賴結構和訊號轉導。研究人員在轉移性TME中觀察到不同的免疫和基質細胞型別，並且確定了與原發性疾病相比的肝臟生態位所特有的間充質特徵。進一步分析則表明癌細胞狀態和區域性TME之間存在著協調關係，在基礎環境中免疫細胞多樣性減少。體內實驗與類器官研究均表明TME提供的細胞因子和免疫啟用在指導癌細胞狀態中發揮著關鍵作用。
圖2
綜上所述，本研究提供了一個可用於在患者來源的腫瘤模型系統中對細胞狀態進行標準化評估、識別轉錄可塑性驅動因素以及評估其在模型系統中的功能意義的系統框架（圖2），該方法將為系統評估細胞狀態以作為癌症靶向特徵提供新途徑。
原文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.017
製版人：十一
參考文獻
1. Garraway, L.A., and Lander, E.S. (2013). Lessons from the cancer genome. Cell 153, 17–37.
2. Hyman, D.M., Taylor, B.S., and Baselga, J. (2017). Implementing Genome-Driven Oncology. Cell 168, 584–599.
3. Hahn, W.C., Bader, J.S., Braun, T.P., et al.; Cancer Target Discovery and Development Network (2021). An expanded universe of cancer targets. Cell 184, 1142–1155.
4. Aguirre, A.J., Nowak, J.A., Camarda, N.D., et al. (2018). Realtime Genomic Characterization of Advanced Pancreatic Cancer to Enable Precision Medicine. Cancer Discov. 8, 1096–1111.
