ACS Catalysis│細胞色素P450對脂肪族與芳香族羥基化在選擇性氧化中的不同幾何要求

今天推送的文章發表在ACS Catalysis的“Different Geometric Requirements for Cytochrome P450-Catalyzed Aliphatic Versus Aromatic Hydroxylation Results in Chemoselective Oxidation”，通訊作者為阿德萊德大學化學系的Stephen G. Bell。

將氧原子插入未活化的C-H鍵是P450 (CYP)單加氧酶催化的最常見的轉化反應。在烷基C-H鍵活化和大多數P450催化反應中，ferryl Cpd I中間體被普遍認為介導氧的插入（方案 1a）。P450酶也能夠有效氧化芳香環的C-H鍵。相比之下，芳環中較強的C-H鍵不會被Cpd I直接奪取H，一般認為透過Cpd I對芳香烴π系統的直接親電攻擊實現C-H鍵氧化（方案1b）。來自沼澤紅假單胞菌HaA2菌株的細胞色素P450酶 CYP199A4 對對位取代的苯甲酸具有高親和力，其中4-甲氧基苯甲酸是最佳底物，且CYP199A4選擇性地氧化對位取代的烷基苯甲酸的取代基。因此，本文將CYP199A4對4-苯基苯甲酸的氧化與4-環己基苯甲酸的氧化（方案2）進行比較，以研究P450酶的芳香族羥基化與脂肪族羥基化的幾何要求。

底物結合和週轉

新增 4-環己基苯甲酸在 CYP199A4 中誘導 ≥95% 的高自旋狀態（表1）。結合親和力和自旋狀態變化的幅度與4-甲氧基和4-乙基苯甲酸相似。4-苯基苯甲酸在CYP199A4中誘導90%自旋態轉變，但結合親和力比4-環己基苯甲酸弱約三倍。CYP199A4氧化4-環己基苯甲酸的產物形成率為52 nmol nmol-CYP^-1min^-1（表 1；此後縮寫為 min^-1）。對4-環己基苯甲酸的氧化產物分析確定形成了兩種主要代謝物，分別為4-(1'-羥基環己基)苯甲酸 (33%)和4-(E)-2'-羥基環己基)苯甲酸 (66%, 方案3)，還有少量4-(環己-1'-烯基)苯甲酸（方案3）。4-苯基苯甲酸在 CYP199A4 系統中誘導NADH氧化，具有高活性（902 min^-1，表1）。然而未鑑定出重要的產物（方案3）。這些反應過程中產生了更高水平的過氧化氫，因此，雖然 4-苯基苯甲酸可以以高親和力與 CYP199A4 結合並啟動催化迴圈，但解偶聯步驟占主導地位（NADH 消耗而沒有產物形成）。

底物結合CYP199A4的X射線晶體結構

為了理解CYP199A4催化4-環己基-和4-苯基-苯甲酸形成的產物差異，作者提出假設4-苯基苯甲酸的芳族π-系統沒有結合在合適的位置以被Cpd I攻擊。為了探索這一點假設，作者獲得了CYP199A4與每個底物結合的的晶體結構。在這兩種結構中，F298殘基佔據的位置與之前發現的與4-甲氧基苯甲酸結合的晶體結構不同，但與之前描述的其他較大的底物或抑制劑相似，例如 4-乙基硫代苯甲酸 (PDB 5U6U)和 4-(吡啶-2-基)苯甲酸 (PDB 6U3K，圖2)。環己基和苯基取代底物的總體結合方向相似（圖 2）。

在環己基環中，最接近血紅素鐵的碳是兩個β-C之一，距離為4.0 Å。α-C（苄基碳）距離血紅素鐵5.4 Å，αC-H 鍵遠離血紅素。環己基環中最近的γ-C離鐵的距離僅比β-C稍遠，為4.2 Å，但偏離血紅素Fe-S鍵的中心（137.8°）。最近的Cβ上的軸向和赤道氫原子分別距血紅素的鐵中心3.5和3.8Å。與 4-環己基苯甲酸底物相比，4-苯基苯甲酸中苯環的芳族 Cα、Cβ 和 Cγ 碳原子距離模擬的Cpd I氧原子稍遠。苯環原子到血紅素鐵的距離與4-環己基苯甲酸的相應脂肪碳原子的距離相似。這些X射線結構表明CYP199A4與兩種底物以相當的親和力結合，但沒有提供關於為什麼只有4-環己基苯甲酸被氧化而 4-苯基苯甲酸沒有被氧化的線索。

量子力學計算和分子動力學模擬

細胞色素P450催化的芳香族和脂肪族氧化的機制不同（方案1）。脂肪族氧化從氫原子提取開始，而芳香族氧化則從 C-O 鍵形成開始。為了理解為什麼CYP199A4不能催化 4-苯基苯甲酸的氧化，作者用量子力學 (QM) 計算了它和 4-環己基苯甲酸的氧化勢壘。對於4-環己基苯甲酸，計算表明優選的氧化位點是苄基 Cα，計算出的氫原子提取自由能壘為 ΔG⧧ = 11 kcal/mol。相比之下，在苯環上不同位置形成C-O鍵的勢壘為ΔG⧧ = 18-25 kcal/mol。這些資料表明，從動力學的角度來看，4-苯基苯甲酸的芳香族氧化確實比 4-環己基苯甲酸的脂肪族氧化更難。然而，這裡計算的兩種型別的氧化（脂肪族和芳香族）的勢壘高度足夠小，兩種底物都很容易反應。事實上，P450 可以催化包括聯苯在內的芳環氧化。

由於脂肪族和芳香族的氧化也涉及底物相對於Fe=O基團的不同空間排列，因此作者假設各個TS的不同幾何要求，連同活性位點內的空間限制，可能會阻礙芳族底物實現所需的 TS 幾何形狀，同時允許脂肪族底物更容易地實現其 TS。這種幾何要求的差異可能會解釋觀察到的 CYP199A4 氧化環己基和苯基取代的苯甲酸能力的差異。為了確定每個底物能夠接近 CYP199A4 活性位點中生產幾何排列(relevant productive geometrical arrangements)的緊密程度，作者對結合 CYP199A4 Cpd I的4-環己基苯甲酸和 4-苯基苯甲酸進行MD模擬。QM模型中的TS結構被視為代表C-H或芳族氧化的“理想”幾何形狀。對於 4-環己基苯甲酸酯的氧化，理想的TS幾何結構具有近乎線性的C-H···O 陣列。其重要的幾何特徵是O-H距離、C-H-O角和Fe-O-H角。圖4顯示了在2000 ns 的MD模擬期間每個環己基氫這三個特徵如何變化。QM的理想TS幾何形態在圖中的每個部分都顯示為一個黑點。在每個QM TS周圍繪製一個虛線框，以包圍其中兩個鍵角在 ±20° 範圍內變化的所有結構。在此餘量內，仍然可以使用僅略高於理想值的能量來實現TS。該分析表明，在模擬過程中，幾個環己基氫原子幾乎從未接近有效取向，但其他原子至少在部分時間達到有效取向（由雙角標準定義）。表2估計了每個氫原子被提取的可能性。

Hα、Hβeq、Hβ′eq、Hγeq 和 Hγ′ax 獲得“生產”方向的相對頻率為 5:51:29:12:3。相應產物的比例為33:63:3:0:0。因此，計算似乎低估了對Hα的提取，而高估了對Hβ'eq、Hγeq和 Hγ'ax的提取。然而，Hβ'eq 最接近 Fe=O 的結合取向，Hα也具有相對接近Fe=O的結合取向。此外，αC-H鍵比β′C-H鍵弱，因為它是苄基的；計算出的Hα提取的QM障礙比 Hβ'eq低3.9 kcal/mol（圖 3）。因此，當底物進入可能產生 Hβ'eq 提取的結合模式時，由於 αC-H鍵較弱，它轉而轉向Hα提取，增加了Hα提取的相對比例並降低了Hβ '當量。接下來考慮4-苯基苯甲酸酯系統。對P450催化芳烴氧化的MD分析採用C-O距離和 Fe-O-C角來識別潛在的氧化位點，圖5顯示了在MD模擬過程中4-苯基苯甲酸酯的苯環碳的這兩個引數。對於芳香族氧化，C-O距離≤4 Å和 Fe-O-C 角在110到140°之間的快照以前已被用於識別反應性結合模式。圖5表明Cδ和Cα與Fe=O基本大於4 Å，然而Cβ和Cγ可以在3 Å或更小的距離內接近Fe=O，同時採用接近理想TS幾何形態（±10°）的Fe-O-C角。基於上述標準的分析會錯誤預測Cβ或Cγ處的羥基化，這種分析似乎並不成功。為了瞭解本研究中觀察到的缺乏反應性，作者進一步研究了氧化的幾何特徵。

控制芳族氧化的另一個重要幾何標準是 Fe=O 對苯環π雲的攻擊軌跡。攻擊軌跡可以透過通用的O–Cx–Cy角和O–Cx–Cy–Cz二面角來定義，其中 Cx 是攻擊位置（圖 6b）。圖6a顯示了MD模擬期間Cβ處的氧化攻角的變化。“理想”的攻擊軌跡被計算為具有100或109°的O-Cβ-Cα角和 ±98 或 ±109° 的 O-Cβ-Cα-Cβ'二面角。QM理想TS顯示為黑點點，虛線框包圍±20°邊距。以這個標準評估MD資料時，很少有MD快照接近理想的TS幾何形狀。當同時考慮C-O距離和攻角時，在Cβ或Cγ氧化的MD快照中，4-苯基苯甲酸酯的排列僅有不到0.1%接近QM的TS，這遠低於對4-環己基苯甲酸酯進行MD模擬時（有11%的排列接近生產幾何）。這表明當4-苯基苯甲酸酯的苯環通常不會以Fe=O基團與苯基π-雲相互作用的正確排列方式接近Fe=O基團。