撰文 | 王克劍、熊傑（中國水稻研究所）
責編 | 奕梵
2022年1月6日，來自荷蘭的 KeyGene育種公司，瓦赫寧根大學及研究中心 (WUR)，日本Takii育種公司，紐西蘭植物與食品研究中心以及林肯大學的研究人員在Nature Genetics線上發表了題為A PARTHENOGENESIS allele from apomictic dandelion can induce egg cell division without fertilization in lettuce的研究論文，報道了一個無融合生殖蒲公英的孤雌生殖等位基因可以使得萵苣卵細胞在不受精的條件下發生細胞分裂。該研究利用自然發生無融合生殖的蒲公英為研究材料，發現了能夠誘導孤雌生殖的基因PARTHENOGENESIS(PAR) ，透過將該基因匯入萵苣，成功獲得可以發生孤雌生殖的萵苣材料。該研究為植物無融合生殖提供了新的基因資源，也為其它作物的無融合生殖材料構建提供了新的思路。
無融合生殖是不經過精卵結合而產生克隆種子的一種生殖方式，獲得的後代與母本植株完全一致，是母體植株的克隆，可隨世代更迭而不改變基因型，性狀也不發生分離。無融合生殖是一種不常發生、但在植物界普遍存在的生殖現象。在植物界存在的有性生殖、無性生殖和無融合生殖三大系統中，無融合生殖是最缺乏研究而又有特殊價值的一種。
無融合生殖基因的挖掘一直比較困難，主要是因為廣為研究的模式植物中並不存在天然的無融合生殖體系，而且無融合生殖材料中染色體之間不存在重組交換，另外現有的無融合生殖植物大多是多倍體。這些條件導致無融合生殖基因的挖掘舉步維艱。
其中，蒲公英則是非常理想的無融合生殖研究材料。蒲公英的二倍體材料可以接收四倍體的花粉，形成三倍體材料。在無融合生殖三倍體材料中，雌株的減數分裂會變成有絲分裂，並且卵細胞在不受精的條件下可以進行自主發育。
蒲公英
PAR基因的挖掘
作者以三倍體無融合生殖材料A68為研究物件，透過伽馬射線照射了2650個單株，以尋找丟失無融合生殖（LOSS OF PARTHENOGENESIS，LOP）表型的種子。A68種子的頭部是黑色的，LOP種子的頭部則不顯現為黑色。透過鑑定13500個種子，找到了23個LOP株系。最終透過AFLP標記鎖定了一個300kb左右的區間。利用BAC文庫和nanopore測序成功構建了PAR區段的完整圖譜，總共發現有3個單倍型，其中一個單倍型與其他兩個（sex1和sex2）差異較大，是顯性無融合生殖（Apo）單倍型（圖1）。透過標記輔助選擇再次將區間縮小至LD2, LD3, LD3, LD4所在的區間，該區間內有13個候選基因（圖1）。作者利用CRISPR–Cas9技術對13個候選基因都進行了基因敲除，發現只有一個基因A_g295的突變體與之前LOP的表型一致，並且A_g295基因的突變體不能進行孤雌生殖，只有授粉才能結實，因此認定A_g295基因就是孤雌生殖基因（PAR）。後續轉錄組資料也證明蒲公英的PAR（TopAR）基因只特異在成熟的卵細胞中表達。
圖1. PAR基因座的結構特徵及LD分析
PAR編碼一個170個氨基酸的蛋白質，含有一個罕見的擬南芥K2-2類的C2H2鋅指結構域，預測具有核酸結合活性。與有性生殖蒲公英PAR蛋白相比，無融合生殖蒲公英的PAR蛋白有5個氨基酸的差異。同時，無融合生殖蒲公英的PAR基因在上游啟動子區有一個1,335bp的片段插入，該片段與已知的所有片段都不同源，被認為是一個全新的微小反向重複轉座因子（MITE），該MITE在所有無融合生殖材料蒲公英中都存在，而在有性生殖蒲公英中都沒有，推測在誘導無融合生殖過程中發揮重要功能。
在山柳菊（Pilosella piloselloides）中也發現了PAR基因作者透過缺失作圖，BCA步移和多倍體定位的方法，將山柳菊可能控制孤雌生殖的LOP區間縮短至650kb的範圍（圖2）。透過分析發現該區間與蒲公英的LOP區間共線性，並且該區間內有一個與蒲公英ToPAR基因同源的片段。分析發現山柳菊PpPAR基因的上游也有一個MITE，只是大小和插入位置與蒲公英不一致，但是與蒲公英的MITE都屬於同一個家族（圖2）。轉錄組資料也證明了山柳菊PpPAR的表達模式與蒲公英的PAR相似。進一步證實了PAR基因能夠誘導無融合生殖的普適性。
圖2. 蒲公英和山柳菊PAR區域共線性分析以及PAR和sex等位基因結構
PAR基因可以誘導孤雌生殖
為了證明蒲公英ToPAR基因的啟動子區是否能夠誘導孤雌生殖，作者利用ToPAR基因啟動子驅動ToPAR同源基因Lssex在四倍體蒲公英突變體中表達（圖3），結果顯示可以成功誘導孤雌生殖。同時，作者利用擬南芥中卵細胞特異表達的基因EC1的啟動子驅動PAR基因在四倍體蒲公英突變體中表達（圖3），結果顯示也可以成功誘導孤雌生殖，證實了ToPAR確實具有誘導孤雌生殖的能力。 為了證實ToPAR是否能夠誘導其他植物的孤雌生殖，作者又將pEC1::PAR匯入萵苣中（圖3）。在得到的7個T0株系中，如果進行去雄處理，有15%的材料出現了胚狀結構，但是這些胚狀結構在發育後期夭折，不能產生有活力的種子。然而將這7個株系T0的花粉授予野生萵苣，獲得的F1後代去雄後能夠成功誘導孤雌生殖。透過流式細胞檢測，發現這些胚狀結構的細胞倍性都是單倍體，進一步證實了孤雌生殖的成功誘導。
圖3. 蒲公英四倍體蒲公英突變體與野生萵苣的互補和轉化實驗
該研究為植物無融合生殖提供了新的基因資源，也為後續孤雌生殖基因的研究提供了良好的研究方法。該論文的通訊作者是瓦赫寧根大學的M. Eric Schranz教授和科因公司Peter J. van Dijk博士。第一作者是科因公司的Charles J. Underwood博士和Diana Rigola博士以及瓦赫寧根大學的Kitty Vijverberg教授。 該文的第一作者Charles J. Underwood已於2019年在德國馬克斯普朗克植物育種研究所染色體生物學系成立了自己獨立的研究團隊。如果有對其研究內容感興趣，想攻讀博士學位或從事博士後工作的科研工作者，可以向其提出正式地申請。招聘資訊連結如下： https://www.arabidopsis.org/download_files/_Job_Postings/20211203_Underwood.pdf
論文連結：https://doi.org/10.1038/s41588-021-00984-y
