文章來自~《哈爾濱商業大學學報》(自然科學版)2021年第2期
作者：李松林，韓 雪，李文娣，姜 山，王 旭
(哈爾濱商業大學 藥學院，哈爾濱 150076)
摘 要：透過網路藥理學技術預測葛根芩連湯治療肺動脈高壓的關鍵活性成分及其可能的作用靶點，探討其作用機制.透過TCMSP平臺收集葛根芩連湯中四味中藥的活性成分及相關靶標，藉助Genecards資料庫獲得肺動脈高壓疾病基因，使用Cytoscape軟體將藥物靶點和疾病基因對映，並對交集靶標進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析.運用AutoDock Vina軟體將核心靶點與活性成分進行分子對接，並使用PyMol軟體繪製圖片.經TCMSP平臺及相關文獻得到146個活性成分，共獲得112個葛根芩連湯治療肺動脈高壓的相關靶點，其中，GO富集分析功能結果顯示參與的條目共160個(P<0.05)，其中有115個條目參與了生物學過程(BP)，有21個條目參與了細胞組成(CC)，還有24個條目與分子功能(MF)有關.此外，KEGG通路富集分析結果顯示有103條訊號通路參與其中(P<0.05)，主要參與的通路包括了HIF-1訊號通路、TNF訊號通路、PI3K-Akt訊號通路、Toll樣受體訊號通路等.透過網路藥理學研究揭示了葛根芩連湯可透過多個靶點、多個訊號通路來治療肺動脈高壓，且關鍵藥效分子與核心靶點均能穩定結合，此研究為進一步探究其作用機制提供了理論基礎.
關鍵詞：葛根芩連湯；肺動脈高壓；網路藥理學；分子對接；訊號通路；富集分析
肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，下簡稱PH)作為高血壓疾病中的一種，此病可誘導右心衰竭甚至引起死亡的一種臨床疾病.在20世紀90年代初臨床上還沒有針對性的藥物，直到近些年才開發出一些藥物，但價格較為昂貴.而在不斷髮展的中醫藥技術過程中，體現出了多種優勢，因此，在臨床上也越來越重視對中藥製劑的使用.
中醫認為PH的病因以“痰濁”、“氣虛”、“血虛”、“血瘀”較為常見[1]，而其病因關鍵為宗氣不足為本，痰瘀阻滯為標[2].在現代臨床中藥方劑中，尋找可以有效治療PH的藥物是更加安全有效的策略.葛根芩連湯出自《傷寒論》，其中以葛根為君藥；黃芩、黃連為臣藥；甘草為佐使藥.該方本用於治療表證誤下之後表邪未解、汗出而喘之證.但隨著現代研究的不斷深入，發現該方適用於“溼熱”、“痰瘀”、“血瘀”、“鬱熱”等證，所以在治療高血壓疾病中發揮了顯著的療效，具有較高的開發前景.因此，本研究透過網路藥理學的方法來探討葛根芩連湯對於PH治療的分子機理，為揭示葛根芩連湯的藥理作用提供參考.
1 實驗方法
1.1 葛根芩連湯中活性成分的篩選
應用中藥系統藥理學資料庫和分析平臺(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索葛根芩連湯中四味中藥的活性成分，將篩選條件設定為口服生物利用度(oral-bioavailability，OB)≥30%、類藥性(durg-likeness，DL)≥0.18，基於資料庫中的ADME引數對檢索的活性成分篩選，並透過查閱相關文獻進一步確定藥物活性成分，最後獲得活性成分的靶點蛋白.為了將蛋白名稱進行標準化透過使用Uniprot資料庫(https://www.uniprot.org/)篩選物種人為加以標定.
1.2 PH相關靶點的篩選
在GeneCards資料庫(https://www.genecards.org/)中檢索關鍵詞“pulmonary hypertension”，選取Relevance score高於10的靶點，得到PH相關的靶點.將PH相關靶點與葛根芩連湯相關靶點取交集並繪製韋恩圖，提取出共同的靶基因.
1.3 構建藥物-活性成分-靶點網路
將獲得的葛根芩連湯中藥物的活性成分靶點與PH靶點的交集資訊整理成Excel表格，並匯入到Cytoscape3.7.1軟體中，調整節點的形狀與顏色便於區別，得到藥物-活性成分-靶點網路.
1.4 構建PPI網路
透過使用線上工具STRING(https://string-db.org/)構建PPI網路關係圖，選擇物種為Homo sapiens，並上傳藥物與疾病的共同靶基因，獲得PPI網路中的關鍵節點基因.
1.5 共同靶點的富集分析
採用DAVID資料庫(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的共同靶點進行富集分析，篩選條件為物種為人同時閾值為P<0.05，進行GO(Gene Ontology)生物學過程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)訊號通路富集分析.
1.6 成分靶點分子對接
對篩選所得的葛根芩連湯中藥物的核心活性成分與PH相關靶點進行分子對接驗證.應用ChemOffice軟體構建活性成分的3D結構來更直觀的顯示活性成分與靶點的相互作用關係圖，使其能量最小化並儲存為*mol2格式；選取PPI網路中度值排名前五的靶點蛋白，並從PDB資料庫(http://www.rcsb.org/)中獲得到靶點蛋白*PDB格式的3D結構；採用PyMOL軟體對蛋白質進行處理，再透過Auto Dock軟體使活性成分及靶蛋白轉換為*pdbqt格式，並執行Vina軟體完成對接，最後再次使用PyMOL軟體將化合物與蛋白對接結果進行分析.
2 實驗結果
2.1 葛根芩連湯中活性成分的篩選與整理
葛根、黃芩、黃連、甘草在TCMSP中檢索得到489個化合物，其中葛根有18個，黃芩有143個，黃連有48個，甘草有280個.透過設定篩選條件為OB≥30%同時滿足DL≥0.18，篩選得到146個活性成分，其中葛根4個，黃芩36個，黃連14個，甘草92個.查閱文獻發現[3]，puerarin、daidzein、daidzin、genistein、sitogluside、scoparone也為其主要活性成分.統計發現方劑中四味藥材所含的活性成分存在交集，見圖1，葛根芩連湯中部分化合物基本資訊見表1.
圖1 葛根芩連湯中藥材的活性成分關係圖
表1 葛根芩連湯中部分化合物基本資訊
2.2 藥物-疾病共同靶點的篩選
藉助TCMSP資料庫收集到葛根芩連湯中146個化合物所對應的靶點共274個；使用GeneCards資料庫選取評分高於10分的PH靶點974個；將葛根芩連湯和PH的靶點取交集後，得到112個共同靶點(圖2)，可能為葛根芩連湯治療PH的關鍵靶點.
圖2 葛根芩連湯-肺動脈高壓共同靶點韋恩圖
2.3 葛根芩連湯-化合物-靶點相互作用網路
葛根芩連湯-化合物-靶點網路關係圖如圖3所示.
其中倒三角形節點表示為共同靶點，圓形節點表示活性化合物，正方形節點表示葛根芩連湯中的四味中藥；每條邊則表示兩個節點間存在相互作用關係.根據網路中的拓撲學性質進行分析，對於一些連線關係較多的節點在整個網路中可能是關鍵的化合物或者靶點.從化合物的角度分析，作用靶點數大於10的化合物有28個，排名前五的化合物分別是MOL000098-槲皮素、MOL000422-山奈酚、MOL000481-染料木黃酮、MOL000390-黃豆苷元、MOL000173-漢黃芩素.從靶點的角度分析，能與10個以上的化合物作用的靶點有13個，排名前五的靶點蛋白分別是PTGS2、ESR1、NOS2、PPARG、PTGS1.
圖3 葛根芩連湯藥材-化合物-靶點網路
2.4 PPI網路的構建
從STRING資料庫中獲取到共同靶點互作網路，見圖4，該網路中包含112個節點(包含一個有利節點)和2 295條邊，其中各靶點的相連節點數見圖5，排名前五的靶點分別是INS、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3.
圖4 共同靶點PPI網路圖
圖5 PPI網路中靶點相鄰節點數
2.5 共同靶點的富集分析
應用DAVID資料庫進行的GO功能富集分析，結果顯示共有160個條目(P<0.05)，其中包括115個生物學過程(BP)條目，21個細胞組成(CC)條目，24個分子功能(MF)條目，見圖6.
圖6 共同靶點的GO功能分析
KEGG分析結果顯示有103條訊號通路(P<0.05)，其中包括HIF-1訊號通路、TNF訊號通路、PI3K-Akt訊號通路、Toll樣受體訊號通路等，其中HIF-1訊號通路涉及EGFR、IL6、ERBB2、STAT3、TIMP1、AKT1、MAPK1、CDKN1A、HIF1A等靶點.選取P值較小的20個通路進行視覺化分析，具體結果見圖7.
圖7 共同靶點的KEGG富集分析:(A:KEGG-P值和基因數目；B：KEGG-基因)
2.6 葛根芩連湯中活性成分作用與核心靶點的分子對接結果
在“葛根芩連湯-化合物-靶點”網路分析中，根據拓撲學引數計算得出排名前10的核心化合物與PPI網路中前十的核心靶點進行分子對接，分子對接結果見圖8，結果顯示，配體與受體結合能量影響著結合構象的穩定性，其能量越低，穩定性越高，相互作用的可能性也隨之變大.本實驗中選取的葛根芩連湯化合物與PH共同靶點的結合能均為負值，皆在-6.72～-37.8 kJ·mol-1範圍內，提示化合物與受體有一定的結合活性.由圖9可直觀的展現出部分活性化合物與受體分子對接模式，證明了葛根芩連湯的活性成分與PH相關的靶標蛋白具有較強的結合活性.
圖8 葛根芩連湯對肺動脈高壓作用靶點分子對接的結合能
圖9 部分活性化合物與受體分子對接模式
3 討 論
肺動脈高壓的發病機制較為複雜，通常認為靜息狀態下平均肺動脈壓≥3.325 Pa即為肺動脈高壓.從中醫角度來說肺動脈高壓的病因主要是以宗氣不足為本，痰瘀阻滯為標[4].因此，臨床治病應以補益宗氣、活血化瘀為主.葛根芩連湯作為中醫藥中的經典方劑，主成分也很常見包括葛根、黃芩、黃連、甘草.這四味藥的主要化學成分研究也比較多，例如葛根中的葛根素、黃連中的小檗鹼、黃芩中的漢黃芩素、甘草中的甘草醇等.有研究表明[5]葛根素對缺氧性肺動脈高壓具有一定作用，黃連中的小檗鹼對肺小動脈收縮也有一定抑制作用[6].目前葛根芩連湯在臨床上應用廣泛，在多種疾病中都具有一定療效，包括對心血管疾病的治療.
本次研究透過網路藥理學的方法，對葛根芩連湯治療肺動脈高壓的可能作用機制進行了預測，共得到146個主要活性成分，112個共同作用靶點，160條生物過程和103條訊號通路.其中，葛根芩連湯的主要活性成分可能是槲皮素、百蕊草素Ⅲ、金雀異黃素、黃豆苷元、漢黃芩素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黃素、葛根素、異黃酮等.另有研究表明，槲皮素可以透過改善肺血管重構達到降壓的效果[7].此外，柚皮素透過顯著增加l -精氨酸達到肺動脈高壓的改善作用[8].金雀異黃素可能透過PI3K/Akt-eNOS來改善肺動脈高壓[9].葛根素可能透過抑制自噬阻止低氧誘導的肺動脈高壓的進展[10].透過網路藥理學技術，從葛根芩連湯中篩選出了對治療肺動脈高壓的重要靶點，主要有INS、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK3、PTGS2、EGF、JUN、MAPK8等作用靶點.IL6作為重要的炎症因子，在肺動脈高壓中具有高表達性[11]，可進一步引起肺血管內皮的損傷，增加血管的阻力，加重病情.VEGFA是血管內皮生長因子，對血管內皮功能具有非常重要的影響，在肺動脈高壓中也有著一定的作用[12].JUN作為重要的調節因子參與細胞的多種活動，對細胞的多種生命活動過程都具有影響[13].透過KEGG通路富集分析篩選得到103條訊號通路，涉及到的HIF-1訊號通路、MAPK訊號通路、TNF訊號通路等通路.HIF-1作為缺氧誘導因子，近幾年研究發現，其對肺動脈高壓具有一定影響，尤其對缺氧性肺動脈高壓影響顯著.MAPK1參與生長因子的訊號傳遞，對細胞的增殖、遷移、侵襲等多種生命活動具有重要的意義[14].TNF訊號通路可以透過促進IL6表達，加重血管內皮的損傷，影響細胞的增殖和調控，使血管阻力增加，加快了肺動脈高壓的發展程序[15].因此，葛根芩連湯可能透過對細胞增殖及炎症等多方面的影響，來改善肺動脈高壓的發展過程.
利用AutoDock Vina軟體對篩選得到的排名靠前的活性成分及靶點蛋白進行分子對接，提示篩選出的潛在靶點和活性成分結合性較高，驗證了運用網路藥理學方法對葛根芩連湯治療肺動脈高壓的機制進行了初步探討的可靠性.
綜上所述，葛根芩連湯對肺動脈高壓病具有多靶點、多通路的治療優勢，但訊號通路及靶點之間的聯絡還需要具體實驗的進一步探討，以便於更好的應用到臨床等相關研究中.
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Study on mechanism of Gegen Qinlian decoction in treatment of pulmonary hypertension
LI Song-lin,HAN Xue,LI Wen-di,JIANG Shan,WANG Xu
(School of Pharmacy，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China)
Abstract：Based on network pharmacology and molecular docking technology to predict the main active components of Gegen Qinlian decoction in the treatment of pulmonary hypertension and target, and explore the mechanism of its multi-component-multi-target-multi-pathway.The active ingredients and related targets of four traditional Chinese medicines in Gegen Qinlian decoction were collected by TCMSP platform, and the genes of pulmonary hypertension were obtained by Genecards database. The drug targets and disease genes were mapped by Cytoscape software, and GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed on the intersecting targets.AutoDock Vina software was used to dock the core targets with active ingredients,and PyMol software was used to draw pictures. 146 active ingredients were obtained from TCMSP platform and related literatures, and 112 targets of Gegen Qinlian decoction for pulmonary hypertension were obtained. 160 items were obtained from GO functional enrichment analysis (P<0.05), including 115 items for biological process (BP),21 items for cell composition (CC),and 24 items for molecular function (MF).KEGG pathway enrichment analysis screened 103 signaling pathways (P<0.05), involving HIF-1 signaling pathway,FoxO signaling pathway, TNF signaling pathway, PI3K-Akt signalingpathway,Toll-like receptor signaling pathway, etc.The network pharmacology study revealed that Gegen Qinlian decoction can treat pulmonary hypertension through multiple targets and multiple signaling pathways, and the key pharmacodynaic molecules can be stably combined with the core targets, which provides a theoretic-al basis for further study of its mechanism of action.
Key words：Gegen Qinlian decoction; pulmonaryhypertension; network pharmacology; molecular docking; signaling pathway; enrichment analysis;
收稿日期：2020-09-12.
基金專案：黑龍江省自然科學基金重點專案(No.160672)
中圖分類號：R285
文獻標識碼：A
文章編號：1672-0946(2021)02-0131-08
