生物樣本大都對溫度極其敏感,尤其是細胞樣本、製品。隨著細胞治療的快速發展,細胞冷凍技術及效果變得更加重要。現在也有一些冷凍降溫是透過高溶度的凍存保護劑保障活率,大劑量的凍存保護劑往往對細胞、回輸受體有害,如何安全有效的提高細胞及製劑的冷凍效果,是一個重要步驟。
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二、生物樣本凍存步驟
圖1為生物樣本凍存步驟:幹細胞採集或分離培養→產品收集或分裝(冷凍血袋或凍存管等)→預冷(一般4℃)→ 新增冷凍保護劑→ 程式降溫→儲存槽暫存→轉移→長期儲存
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圖1 生物樣本凍存步驟
生物樣品的成功凍存不僅取決於合適的冷凍保護劑,更取決於冷凍的速率、精確的溫度控制和合理的溫度梯度(40℃~80℃)。
在細胞凍存的過程中,樣本內水分會從液相轉變為固相,水分也隨之散失,導致細胞內鹽、代謝物濃度改變,進而造成滲透壓失衡,直接影響凍存細胞的復甦。同時冷凍的速率太快或者太慢,容易導致細胞內水分喪失或形成大冰晶,都不利於細胞存活。另外,生物樣本內水分的相變過程也伴隨著潛熱釋放的現象,在從液相轉變為固相時會釋放出大量熱量,使樣本溫度瞬速上升(圖2),細胞往往會在溫度劇烈變化中死亡。透過使用細胞欣諭程式降溫儀,選擇合適的凍存液,設定合適的升降溫速率,可有效地克服上述不利因素。實踐證明,(經溫度補嘗後)每分鐘1-3℃的冷凍速率可大大提高凍存細胞的存活率。
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圖2 從液相轉變為固相時釋放出大量熱量
傳統的生物樣本降溫通常採用-80℃低溫冰箱進行分步驟冷凍,該方法的不足為:耗時長,整個降溫過程大約需要一天的時間;在降溫過程中需要人為多次轉移,給樣本的降溫帶來眾多不可控因素,從而導致樣本的存活率降低;無法有效地消除結晶過程中釋放的潛熱,增大了樣本的死亡率。
當然還有一些特殊生物樣品的製備工藝和程式降溫需要的溫度更低,所以更需要程式降溫儀這款裝置,目前欣諭品牌程式降溫儀可以控制溫度40~--180度,溫度點控制準確度小於等於0.5度。
生物樣品的成功凍存取決於冷凍的速率,精確的溫度控制和合理的溫度梯度(+40℃ -180℃)。當溫度降至-180℃時,大部分生物樣品可轉移至液氮中長期儲存。
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