人類多能幹細胞(hPSCs)因其擁有分化為機體所有型別細胞的能力，使得hPSCs成為研究發育機制以及疾病機理最常用的工具，同時在再生醫學以及疾病治療領域也有非常廣泛應用。人類多能幹細胞因其來源不同又可分為胚胎幹細胞（Embryonic stem cell，ESCs）和誘導多能幹細胞（induced pluripotent stem cells,iPS cells）。
小鼠胚胎幹細胞由Martin Evans在1970年首次從小鼠胚囊中分離獲得，小鼠胚胎幹細胞就可以成功地在體外進行培養。人的胚胎幹細胞的體外培養在1998年由美國科學家James Thomson培養成功。
誘導多能幹細胞是日本科學家山中伸彌（Shinay Yamanaka）團隊在2006年利用病毒載體將Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc四個轉錄因子轉入小鼠胚胎成纖維細胞重程式設計而成。iPS細胞在細胞形態、基因蛋白表達、表觀遺傳修飾以及畸胎瘤形成能力與胚胎幹細胞非常相似。2007年11月，山中伸彌實驗室成功將人類面板纖維母細胞誘導成iPS細胞。2009年我國科學家周琪院士與曾凡一教授，首次利用iPS細胞，透過四倍體囊胚注射得到存活並具有繁殖能力的小鼠，世界上首次證明了iPS細胞的全能性。
下面對多能幹細胞不同培養體系以及傳代方法進行分析：
多能幹細胞最常見的培養體系有可以分為有血清培養系統跟無血清培養系統：
有血清系統為基礎培養基配幹細胞級血清，同時新增bFGF等生長因子，此方法對血清要求較高，在目前國內血清比較亂的情況下，購買的合格的血清是制約細胞培養的主要因素，同時該體系還需要滋養層細胞，培養方法較複雜。
無血清幹細胞培養系統發明大大簡化了幹細胞培養流程，目前常用的為Gibco Essential8培養基與Stemcell Technologies 的mTesR系統。兩種系統均為無血清，不需要額外新增生長因子，同時擺脫了滋養層細胞的限制，透過包被培養板就可以達到細胞貼壁的目的。但是，以上兩種培養基價格不菲，同時因為含有牛血清白蛋白（BSA）經常會有進口限制。以上產品也均有國內替代，Applied Cell分別有人類多能幹細胞培養基（適用於Essential8 系統），以及Advance 人類多能幹細胞培養基(適用於mTesR系統)。
培養皿包被：目前有兩種常見的包被方法，分別為Matrix基質膠包被以及 Vitronectin包被，以上兩種膠對溫度非常敏感，操作要求較高，需要全程低溫操作，同時現配現用。針對以上問題現在多家公司均有有即用型基質膠（Gibco,Stemcell Tech,Applied Cell）推出。
傳代：幹細胞傳代經過多年發展也逐步簡化，最初透過膠原酶消化，挑克隆法傳代；後續發展出機械傳代發，多家公司也推出了細胞切割工具；至目前已經可以做到使用消化液完成消化，消化液種類也多種多樣，分別有Accutase,Tryple以及無酶消化液，均可以達到很好的傳代效果。
以下另附多能幹細胞培養操作手冊：
人類iPS/ES細胞復甦操作：
人類iPS/ES細胞的復甦標準操作包括實驗前準備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細胞的復甦標準操作：
1. 實驗前準備工作：
1.1 基質膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，每孔內加入1 mL/0.5 mL即用型基質膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質膠完全覆蓋皿底，然後置於37℃，5% CO2培養箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出並置於超淨工作臺/生物安全櫃中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口後2-8℃ 儲存，並於1周內使用。
注意：①幹細胞復甦過程中的基質膠鋪板數由凍存細胞密度決定，一支凍存的幹細胞的密度在1×106cells/mL左右，需要6孔板鋪1孔或12孔板鋪2孔基質膠；②即用型基質膠受熱易發生沉澱，即用即拿及時放回4℃冰箱儲存且勿用手直接觸碰基質膠液麵所及的瓶身，防止生成沉澱，影響基質膠質量。
1.2 實驗試劑平衡：人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000）在實驗前置於室溫中避光平衡30min~1h。
1.3 超淨工作臺/生物安全櫃照射紫外：在實驗前開啟紫外燈照射30min進行滅菌。
1.4 恆溫水浴鍋準備：水浴鍋溫度設定在37℃用於hPSC細胞復甦。
2. 實驗具體操作步驟：
2.1 提前加入人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000）：復甦前，先在15mL離心管中加入2~3mL的幹細胞條件培養基備用。
2.2 解凍：將從液氮中取出的凍存管快速浸入37℃溫水中，快速搖動，使其在1~2min內快速解凍；
注意：細胞從液氮中拿出的速度要快，儘量減少其暴露在室溫中的時間。
2.3 離心：凍存管中的凍存液解凍後，將其吸出並緩慢逐滴滴入提前在15mL離心管中加入的幹細胞條件培養基中，將15mL離心管置於低速離心機中配比平衡後，1000rpm/min離心3min；
2.4 重懸：離心後棄上清加1mL人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000） 對幹細胞沉澱進行吹吸混勻，吹吸3~5次左右。
2.5 接種：吹吸均勻後，將已經平衡好的即用型基質膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細胞懸液，緩慢吹吸3~5次，待細胞懸液混勻後，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內，且補全每孔2 mL/1 mL的培養體系。
2.6 培養：接種後的6孔板/12孔板可以置於倒置相差顯微鏡下觀察接種的幹細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分佈。並置於37℃，5% CO2的恆溫培養箱培養，第2天觀察細胞貼壁情況；
2.7 換液：從復甦的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應及時更換新鮮培養基。
人類iPS/ES細胞擴增操作：
人類iPS/ES細胞的擴增標準操作包括實驗前準備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細胞的擴增標準操作：
1. 實驗前準備工作：
1.1 基質膠鋪板、孵育及平衡：取出6孔板/12孔板，根據細胞密度決定傳代的孔數（細胞密度中等則可以按照1:2傳代，密度大則按照1:3或4傳代），並在每孔內加入 1 mL/0.5 mL即用型基質膠（AC-1001007），輕輕晃動6孔板/12孔板使基質膠完全覆蓋皿底，然後置於37℃，5% CO2培養箱中孵育1h~2h，在實驗前拿出並置於超淨工作臺/生物安全櫃中室溫下平衡20min或2-8℃靜置過夜備用。如果暫時不用，可用Parafilm封口後2-8℃ 儲存，並於1周內使用。
注意：①通常早代次(<10代)的幹細胞需要以較低的比例傳代，如1:2-1:3；成功建系的幹細胞（10代以上）可以1:4-1:5的比例傳代，傳代的比例由細胞株的生長速率決定。比較理想的傳代時間間隔是3-5天一次，剛剛復甦的細胞第一次傳代時間一般是復甦後第5天。②即用型基質膠受熱易發生沉澱，即用即拿及時放回4℃冰箱儲存且勿用手直接觸碰基質膠液麵所及的瓶身，防止生成沉澱，影響基質膠質量。
1.2 實驗試劑平衡：人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000）、人類多能幹細胞無酶消化液（AC-1001008 ）以及PBS緩衝液在實驗前置於室溫中避光平衡30min~1h。
1.3 超淨工作臺/生物安全櫃照射紫外：在實驗前開啟紫外燈照射30min進行滅菌。
2. 實驗具體操作步驟：
2.1 清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000），貼壁緩慢加入1 mL/0.5 mL PBS緩衝液並輕輕晃動，然後沿培養皿邊緣吸去 PBS緩衝液；
2.2 消化：在6孔板/12孔板中加入1 mL/0.5 mL人類多能幹細胞無酶消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，並置於CO2培養箱中2~5 min；
注意：消化時間依據幹細胞生長密度，如果密度中等且培養2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養4天以上消化時間可以控制在3 min~5min，消化時間快結束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內部細胞間出現間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。
2.3 吹打：吸掉人類多能幹細胞無酶消化液（AC-1001008）後，立刻加入平衡好的2mL/1mL幹細胞條件培養基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養皿底，吹吸次數保持在3~5次，使皿底貼附的幹細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，製成幹細胞懸液，並將其並轉移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數在3~5次為宜，儘量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬於正常現象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4 接種：待皿底的細胞全部吹下並加入到15mL離心管後，將已經平衡好的即用型基質膠（AC-1001007）棄掉，緩慢吹吸15mL離心管中的細胞懸液，緩慢吹吸1~2次，待細胞懸液混勻後，加入到6孔板/12孔板中鋪膠的孔內，且補全每孔2mL/1mL的培養體系。
2.5 培養：接種後的6孔板/12孔板可以置於倒置相差顯微鏡下觀察接種的幹細胞密度以及細胞團塊大小，呈4個細胞以上的團塊較合格，水平十字輕輕晃動6孔板/12孔板使細胞均勻分佈。並置於37℃，5% CO2恆溫培養箱培養，第2天觀察細胞貼壁情況；
2.6 換液：從傳代的時間開始每24h換液一次。
注意：因培養基中活性成分只足夠維持一天，所以每24h應及時更換新鮮培養基。
人類iPS/ES細胞凍存操作：
人類iPS/ES細胞的凍存標準操作包括實驗前準備工作和實驗過程中的具體操作，下面即人類iPS/ES細胞的凍存標準操作：
1. 實驗前準備工作：
1.1 實驗試劑平衡： 人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000）、人類多能幹細胞無酶消化液（AC-1001008）以及PBS緩衝液在實驗前置於室溫中避光平衡30min~1h。
1.2 超淨工作臺/生物安全櫃照射紫外：在實驗前開啟紫外燈照射30min進行滅菌。
2. 實驗具體操作步驟：
2.1 清洗：拿出6孔板/12孔板棄去舊的人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000），貼壁緩慢加入2mL/1mL PBS緩衝液並輕輕晃動，然後沿培養皿邊緣吸去 PBS緩衝液；
2.2 消化：在6孔板/12孔板中加入2mL/1mL人類多能幹細胞無酶消化液（AC-1001008）使之覆蓋皿底，並置於CO2培養箱中 2~5min；
注意：消化時間依據幹細胞生長密度，如果密度中等且培養2~3天，消化時間可以控制在2 min~3min，若密度很大且培養4天以上消化時間可以控制在3 min~5min ，消化時間快結束時可以拿到倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若在顯微鏡下觀察到大部分克隆邊緣以及克隆內部細胞間出現間隙，即刻吸掉無酶消化液停止消化。
2.3 吹打：吸掉人類多能幹細胞無酶消化液（AC-1001008）後，立刻加入平衡好的 1~2 mL人類多能幹細胞條件培養基（AC-1001000），用移液槍扇形吹打培養皿底，吹吸次數保持在3~5次，使皿底貼附的幹細胞集落脫落，輕柔緩慢吹吸混勻，製成幹細胞懸液，並將其並轉移到15mL離心管中；
注意：吹吸皿底細胞的力度要輕柔，吹打脫落和吹吸混勻的次數在3~5次為宜，儘量避免形成單細胞。如有少量細胞無法從皿底脫落，屬於正常現象。如有大量細胞無法從皿底脫落，需延長消化時間。
2.4 離心：待皿底的細胞全部吹下並加入到15mL離心管後，將15mL離心管置於低速離心機中配比平衡後，1000 rpm/min離心3 min；
2.5 重懸：離心後棄上清，加入1 mL Serum-Free幹細胞高效凍存液（AC-1001011/AC- 1001012）對幹細胞沉澱進行吹吸混勻，吹吸3~5次後，將其加入到1.8mL凍存管中；
注意：凍存液即用即拿，及時放回4℃冰箱。通常生長狀態相同且同時消化的細胞統稱為一批細胞。
2.6 記錄：在凍存管上標記凍存細胞種類、時間、操作者及細胞批次。
2.7 -80℃冰箱平衡：凍存管置於-80℃冰箱過夜。
注意：凍存管放置於-80℃冰箱時，要將凍存管直立放置，切忌凍存管斜放或橫放。
2.8 液氮凍存：凍存管置於 -80℃冰箱過夜後，第2天將其置於液氮中進行長期儲存。
