PBJ | 高效的大豆無標記轉化方法

植物轉化技術在植物生物學研究中發揮重要作用。目前農桿菌介導的轉化和粒子轟擊是最常用的DNA傳遞方法。除了農桿菌外，其它一些細菌已被證明能夠在擬南芥，菸草和水稻中進行轉化，但是存在轉化效率低的問題。大豆(Glycine max (L.))是全球最重要的作物之一，也是食品和飼料蛋白質的重要來源。轉基因大豆是最早引入商業化種植的轉基因作物之一，也是世界上種植面積最大的轉基因作物。因此，高效的轉化方法至關重要。農桿菌介導的大豆轉化存在著許多侷限性，目前在大豆中還沒有一種替代細菌能夠有效地地轉化大豆。近日Plant Biotechnology Journal線上發表了一篇題為“Development of an efficient marker-free soybean transformation method using the novel bacterium Ochrobactrum haywardense H1”的研究論文，該文作者發現了一種新的細菌—O.haywardense H1 (Oh H1)，並證明Oh H1能夠轉化許多雙子葉植物和至少一種單子葉植物—高粱。作者對Oh H1進行了改造，生成了一株含有二元載體系統的半胱氨酸營養型Oh H1-8菌株，在大豆中實現了高效、快速、無標記和產量中性的優質大豆轉化系統。

透過對菸草by -2細胞轉化的高通量篩選菌株文庫進行篩選，發現了一株能夠轉化植株的新菌株O. haywardense H1。O. haywardense H1是一種革蘭氏陰性菌，最初透過生化試驗確定為赭桿菌屬的一員。作者發現O. haywardense H1可以在灌木豆，本氏煙，高粱和擬南芥中實現穩定轉化。與其他大豆再生轉化系統相比，用O. haywardense H1轉化的大豆胚軸（EA）外植體在壯觀黴素培養基上直接從頂端分生組織進行器官發生，植株再生和轉化效率均有提高（圖1）。在T0再生植株上，最高轉化效率高達35%，是之前報道的15.8% (Liu et al.， 2004)和16.4%農桿菌介導的大豆的兩倍以上(Olhoft et al.， 2003)。

圖1 大豆胚軸頂端分生組織轉基因苗的發育階段及轉基因植株的產生

載體中標記基因的存在會影響相鄰性狀基因的表達，此外，許多標記基因會產生抗生素耐藥性，理想的轉化系統是在最終植株中不保留標記基因。為了開發一種生產無標記轉基因大豆植物的有效方法，作者使用位點特異性重組系統和Cre重組酶基因，在兩個直接重複的loxP位點之間放置需要切除的序列，Cre基因受GmHSP17.3B啟動子控制，在高溫處理T0苗時可引發切除loxP位點之間的基因。大豆品種93Y21、P29T50和P33T50 T3零分離系的田間表現在植株形態、生長習性、出苗率和種子產量等方面與野生型對照相當。

O. haywardense H1菌株對多種β-內醯胺類抗生素(timentin、carbenicillin、cefotax肟)表現出部分耐藥，導致細菌在植物轉化過程中過度生長，作者成功培育出β-內醯胺類抗生素敏感型和半胱氨酸營養失調型突變株O. haywardense H1-8，該突變株在共培養後易於去除細菌。並且Oh H1-8轉基因大豆植株的效率是農桿菌AGL1的1.6倍，LBA44044Thy-的2.9倍（圖2）。當與胚軸組織培養系統、壯觀黴素選擇和誘導標記切除相結合時，O. haywardense H1-8獲得了一種快速、高效、無標記的大豆多種質轉化新方法。

圖2大豆93Y21胚軸(EA)透過不同菌株轉化

原文連結： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/pbi.13777

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