（現代生物科技專題）

【知識框架】

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基因工程、細胞工程

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胚胎工程

1. 生態工程

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【基礎必備】

一、基因工程 原理：基因重組 優點：克服遠緣雜交不親和的障礙

1、基因工程的 3 種基本工具

①限制性核酸內切酶：識別特定脫氧核苷酸序列，並在特定位點上切割 DNA 分子。

②DNA 連線酶：a.E·coli DNA 連線酶只能連線黏性末端；b.T4 DNA 連線酶能連線黏性末端和平末端（效率低）。

③載體：需具備的條件：a.能在宿主細胞內穩定存在並大量複製；b.有一個至多個限制酶切割位點；c.具有特殊的標記基因，以便對含目的基因的受體細胞進行篩選。

2、基因工程的四步驟

目的基因的獲取→基因表達載體的構建→將目的基因匯入受體細胞→目的基因的檢測與鑑定

第一步：目的基因的獲取

途徑：從基因文庫中獲取、利用 PCR 技術擴增、化學方法直接人工合成

（1）基因組文庫中包含了某種生物的全部基因，而 cDNA 文庫是由 mRNA 反轉錄產生的， 因此無基因中的啟動子和基因中的內含子，包含某種生物的部分基因。

（2）PCR 技術：DNA 解旋（90-95℃）、引物結合（55-65℃）、互補鏈合成（70-75℃）

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1. 此過程反應體系的主．要．成．分．包含：擴增緩衝液、水、原料（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）；兩種引物、耐高溫的 DNA 聚合酶、模板 DNA 等。
2. 一個 DNA 經過 4 輪迴圈後同時含有兩種引物的 DNA 片段所佔的比例是 7/8
3. 設計引物的依據是目的基因兩端的部分序列核苷酸
4. 設計引物的注意點是：一是兩種引物之間不能鹼基互補配對；一種引物自身不能鹼基互補

配對而出現自身摺疊。

1. 此過程中退火（復性）的溫度必須根據引物的鹼基數量和種類來設定，一般引物對中G-C

含量高的可採用較高的退火溫度。

第二步：基因表達載體的構建（基因工程的核心步驟）

1. 構建基因表達載體的目的是使目的基因在受體細胞中穩定存在並遺傳，同時能表達和發揮作用。
2. 表達載體主要包括啟動子（化學本質是 DNA 片段，它是 RNA 聚合酶識別和結合的部位，它的作用是啟動目的基因的轉錄）、終止子、目的基因、標記基因（鑑定受體細胞中是

否含有目的基因）、複製原點等。（記住組成及作用！）

第三步：將目的基因匯入受體細胞

1. 受體細胞是植物細胞時常用的匯入方法是：農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法。

（1）農桿菌轉化法：將目的基因與 Ti 質粒（含有 T-DNA）結合構建表達載體、將表達載體匯入農桿菌，再用含有重組 Ti 質粒的農桿菌匯入植物細胞，利用 T-DNA 可轉移的特點，將目的基因插入到植物細胞的染色體 DNA 上，再利用植物組織培養技術技術將匯入了目的基因的植物細胞培養成新的植株。

1. 受體細胞是動物細胞時匯入方法是顯微注射法。常見的動物受體細胞是受精卵或者胚胎幹細胞，原因是這些細胞的全能性高。

★乳腺生物反應器：

將藥用蛋白基因與乳腺蛋白基因的啟動子等調控元件重組在一起，透過顯微注射的方法， 匯入到哺乳動物的受精卵中，然後將受精卵送入母體，使其生長髮育成轉基因動物。

1. 受體細胞是微生物細胞時匯入方法是用 Ca2+處理。

（1）基因工程常選擇微生物細胞作為受體細胞的原因是多為單細胞生物、遺傳物質較少； 繁殖快。（2）當受體細胞是大腸桿菌時，由於該生物細胞內沒有內質網和高爾基體，因此從中提取出的蛋白質還要經過人工修飾才具備生物活性。

第四步：目的基因的檢測與鑑定方法

①檢測目的基因是否插入轉基因生物的 DNA 上：DNA 分子雜交技術。

②檢測目的基因是否轉錄出 mRNA：分子雜交技術。

③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原—抗體雜交技術。

④個體生物學水平鑑定：根據表達性狀等判斷。易混辨析

①限制酶、DNA 酶、解旋酶

限制酶的作用是識別雙鏈 DNA 分子上某種特定的核苷酸序列，並使兩條鏈在特定的位置斷開；DNA 酶的作用是將 DNA 水解為基本組成單位；解旋酶的作用是將 DNA 兩條鏈間的氫鍵開啟形成兩條單鏈。

②DNA 連線酶、DNA 聚合酶

DNA 連線酶能連線兩個 DNA 片段，而 DNA 聚合酶只能將單個脫氧核苷酸新增到脫氧核苷酸鏈上。

③啟動子(DNA 片段、RNA 聚合酶識別結合的部位、啟動轉錄)、起始密碼子(位於 mRNA

上，翻譯的開始)；

終止子(DNA 片段、終止轉錄)、終止密碼子(位於 mRNA 上，翻譯的結束)。

二、植物細胞工程

1、兩個重要的技術：植物組織培養技術、植物體細胞雜交技術

2、植物組織培養技術提醒：①條件：離體、營養物質、激素、適宜的溫度和 pH 等；②包括脫分化形成愈傷組織（分裂旺盛、高度液泡化的薄壁細胞，可作為誘變育種的材料）、再分化形成植株。③在脫分化和再分化過程生長素和細胞分裂素的比例不同，脫分化過程需要避光培養、再分化過程需要光照。④植物組織培養技術不一定得到完整植株，可以得到細胞產物: 若生產人工種子，則培養到胚狀體階段；若提取細胞產物，則一般培養到愈傷組織階段；若培育新個體，則應培養到試管苗階段。⑤可以結合微生物的實驗室培養過程的滅菌操作考查。

3、植物體細胞雜交提醒：

1. 包括植物細胞融合和植物組織培養；
2. 區別植物細胞融合和動物細胞融合的方法的不同；
3. 植物體細胞雜交的結果實得到植株，而動物細胞融合得到是細胞產物；
4. 植物細胞融合後得到的植株的染色體數目是兩個細胞之和
5. 植物體細胞雜交技術的意義——克服了遠緣雜交不親和的障礙，大大擴大了可用於雜交的親本組合範圍。
6. 區分抗病毒植株和無毒植株（不帶病毒）的培育方法： 抗病毒植株：基因工程，匯入相應抗病毒基因

脫毒植株：植物組織培養，利用植物分生區附近（如莖尖）的植物病毒極少，甚至無病毒， 利用莖尖進行組織培養，再生的植株可能不帶病毒，從而獲得脫毒苗。

三、 動物細胞工程（動物細胞培養、動物細胞融合、動物細胞核移植）

1、動物細胞培養：

1. 關鍵詞：胰蛋白酶或膠原蛋白酶、細胞懸液、原代培養、傳代培養、細胞貼壁、接觸抑制。提醒：用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使組織細胞分離開來；原代培養可保持細胞正常的二倍體核型，傳代培養後部分細胞出現不死性；細胞貼壁後才能生長稱之為細胞貼壁，相互接觸的細胞不再生長和分裂，稱為接觸抑制。
2. 動物細胞培養原理：細胞增殖。
3. 植物組織培養用的是固體培養基，加入的是細胞分裂素、生長素和蔗糖（蔗糖的作用 ：提供能源、調節滲透壓）等；動物細胞培養用的是液體合成培養基，加入的是葡萄糖、血漿、血清等，還需要氧氣、二氧化碳（維持培養液 pH 的穩定）等氣體條件。

2、單克隆抗體的製備至少需要兩次細胞篩選：第一次篩選出雜交瘤細胞（用選擇培養基）； 第二次用相應的抗原檢測篩選出產生特定抗體的雜交瘤細胞（抗原—抗體雜交）。雜交瘤細胞的特點是：既能迅速大量增殖，又能產生特定抗體。單克隆抗體的優點是：特異性強、靈敏度高、可大量製備。作用是作為診斷試劑、治療疾病、運載藥物。

3、動物細胞核移植的受體細胞是減數第二次分裂中期的去核的卵母細胞。

選擇受體細胞為去核卵母細胞的原因：①營養豐富；②體積大，易操作；③含有激發細胞核全能性表達的物質。

四、胚胎工程

1、受精的標誌是卵細胞膜和透明帶的間隙可以觀察到兩個極體，受精完成的標誌是雌雄原核融合完成。

2、早期胚胎培養中培養液的成分：無機鹽、有機鹽(兩鹽)；維生素、激素(兩素)；氨基酸、核苷酸(兩酸)，以及血清等物質。

3、用卵巢採集的卵母細胞需要在體外人工培養到減數第二次分裂中期才能與獲能的精子受精。（注射促性腺激素，超數排卵，從輸卵管衝取的卵子可直接與獲能的精子受精）

4、胚胎移植僅屬於一種技術，移植的是透過有性生殖或無性生殖產生的胚胎，其本身並不是一種生殖方式。

5、胚胎移植的生理學基礎：①供、受體生殖器官的生理變化相同；②早期胚胎與母體子宮無組織上的聯絡；③受體對移入子宮的外來胚胎基本上不發生免疫排斥反應；④供體胚胎可與受體子宮建立正常的生理和組織聯絡。

6、胚胎移植過程中兩次使用激素：第一次是對供、受體母牛進行同期發情處理（一般用孕激素）；第二次用於供體母牛的超數排卵（注射促性腺激素）。

7、衝卵是從供體母牛體內獲得早期胚胎的過程，而不是獲得受精卵或卵細胞。

8、胚胎移植過程中兩次檢查：第一次對收集的胚胎進行質量檢查；第二次對受體是否妊娠進行檢查。

9、胚胎分割的材料：發育良好、形態正常的桑椹胚或囊胚。囊胚的內細胞團均等分割，以免影響分割後胚胎的恢復和進一步發育。（滋養層—性別鑑定）（識記胚胎髮育的過程！） 10、用來進行胚胎移植的胚胎來源：體內正常受精產生的胚胎、核移植產生的重組細胞培養而來的胚胎、體外受精產生的早期胚胎。

11、胚胎幹細胞來源於早期胚胎或從原始性腺中分離出來的一類細胞，具有體積小、細胞核大、核仁明顯等特點，具有發育的全能性。另外，在體外培養的條件下，ES 細胞可以增值而不發生分化。對它進行冷凍儲存，也可以進行遺傳改造。

五、生態工程

1、特點：少消耗、多效益、可持續。

2、研究物件：“社會—經濟—自然”複合系統。

3、生態經濟主要是透過實行“迴圈經濟”的原則，使一個系統產出的汙染物，能夠成為本系統或者另一個系統的生產原料，從而實現廢棄物的資源化，而實現迴圈經濟最重要的手段之一就是生態工程。

它遵循的基本原理如下。

注意：並不是某個例子只對應某一個生態工程原理，一般每個例子都會對應幾個原理。