I. 儲存
A. 凍存管 (104-05a, 104-05n)
將細胞放入凍存管後須立即儲存在液氮儲罐中。
*從液氮儲罐中取出凍存管時，請務必戴上面罩和手套。從液氮儲罐到房間的劇烈溫度變化可以導致凍存管中存留的任何液氮爆裂並造成人員受傷。更多內容到默克sigma試劑官網檢視：www.sigmaaldrich.cn
人表皮黑素細胞(HEM)
- 確保具有HEPA過濾層流的II級生物安全櫃處於正常工作狀態。
- 用70％酒精對生物安全櫃消毒。
- 在開始細胞培養工作之前，開啟生物安全櫃風機10分鐘。
- 確保所有血清移液器、移液器吸頭和試劑溶液都是無菌的。
- 遵守標準無菌技術和安全規則：
a.不要用嘴吸移液管。 b.在處理人類細胞時始終佩戴手套和護目鏡，即使所有菌株均已經過測試為HIV、乙肝和丙肝病毒陰性。 c.在無菌超淨臺內處理所有細胞培養工作。
A. 為HEM培養準備細胞培養瓶
- 從冰箱中取出黑素細胞生長培養基。在無菌超淨臺中用70％酒精給瓶子消毒。
- 吸取15 mL人表皮黑素細胞生長培養基置於T-75培養瓶中。
*保持培養基與表面積的比例在每5 cm2 1 mL。
例如：
一個T-25培養瓶或一個60 mm組織培養皿使用5 mL培養基。
一個T-75培養瓶或一個100 mm組織培養皿使用15 mL培養基。
B. 解凍和接種HEM
- 佩戴合適的護目鏡和手套，從液氮罐中取出HEM凍存管。
- 將瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能被困在螺紋中的液氮，然後重新擰緊瓶蓋。
- 將小管的下半部分放在37°C水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小管。
- 當小管中僅有少量冰時，從水浴中取出小管。請勿讓細胞完全解凍。
- 在無菌生物安全櫃中用70％酒精對小管外部消毒。
- 小心取下小管蓋。請勿用手觸控蓋子或小管的邊緣，以免汙染。
- 用2 mL移液管輕輕吹5次，將細胞重懸於小管中。小心不要過於劇烈地移液以免起泡。
- 用移液管從凍存管中取出細胞懸液（1 mL）,轉移至含有15 mL人表皮黑素細胞生長培養基的T-75培養瓶中。
- 蓋上培養瓶並輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
- 將T-75培養瓶放在37 °C、5% CO2加溼培養箱中。鬆開蓋子以便換氣。為獲得最佳結果，接種後24小時之內不要擾動培養物。
- 24小時或過夜後更換為新鮮的黑素細胞生長培養基，以除去所有殘留的DMSO。
- 每隔一天更換黑素細胞生長培養基，直至細胞達到60%融合。
- 當培養細胞融合率達到60%以上或週末飼餵時，將黑素細胞生長培養基用量加倍。
- 當HEM達到80%融合時，進行細胞傳代。
A. 準備傳代試劑
- 從-20 °C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液和胰蛋白酶抑制劑，置於冰箱中解凍過夜。
- 確保解凍所有傳代培養試劑。輕輕旋轉每個瓶子幾次，形成均勻的溶液。
- 將所有傳代培養試劑儲存在4°C以備將來使用。
- 分裝胰蛋白酶/EDTA溶液。如果只需要使用一部分胰蛋白酶/EDTA溶液，則將未使用部分儲存在-20 °C。
B. 準備培養瓶
- 從冰箱中取出黑素細胞生長培養基。在無菌超淨臺中用70％酒精給瓶子消毒。
- 吸取30 mL黑素細胞生長培養基置於T-175 培養瓶中（用於第IV C部分步驟15）。
C. HEM傳代培養
在室溫下對細胞進行胰蛋白酶消化。請勿將任何試劑加熱至37°C。
- 從培養瓶吸取培養基。
- 使用HBSS清洗單層細胞，並吸出溶液。
- 吸取5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液置於T-75培養瓶中。輕輕搖動培養瓶以確保溶液覆蓋所有細胞。
- 立即吸取4 mL的溶液。
- 重新蓋緊培養瓶蓋子，並在倒置顯微鏡下在室溫下監測胰蛋白酶消化過程。細胞通常需要2至4分鐘才能變圓。細胞在胰酶消化過程中可能不會完全變圓，並且有些細胞可能會在脫離培養表面後依然處於消化程序中。
- 用手掌拍打培養瓶側面，使圓細胞從培養表面釋放，直至大部分細胞脫落。
- 向培養瓶中加入5 mL胰蛋白酶抑制劑溶液，以抑制進一步的胰酶消化活性。
- 將細胞懸浮液從培養瓶轉移至50 mL無菌錐形管中。
- 再次向培養瓶中加入5 mL胰蛋白酶抑制劑溶液進行清洗，並將溶液轉移至同一錐形管中。
- 在顯微鏡下檢查T-75培養瓶。如果培養瓶中剩餘> 20％的細胞，請重複步驟2-9。
- 將錐形管以220×g離心5分鐘以沉澱細胞。
- 從錐形管中吸取上清液而不擾動細胞沉澱。
- 用手指輕彈錐形管的尖端以鬆開細胞沉澱。
- 用移液管輕輕吹打細胞以分散細胞團塊，使細胞重懸於 5 mL黑素細胞生長培養基中。
- 用血細胞計數板或細胞計數器計數細胞。如想使細胞快速生長，則接種密度為10,000個細胞/cm2，如想使細胞進行常規傳代培養，則則接種密度為6,000個細胞/cm2。
