目的基因不能直接整合到大多數真核細胞，常用的手段是將目的基因包裝成病毒來感染細胞，從而得到表達滿足實驗需求。病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒。關於慢病毒和腺病毒的原理以及特別前面的文章中都有介紹過，可以搜尋關鍵字檢視。今天主要介紹病毒感染細胞的實驗流程。
1.構建目的基因到載體
- 構建手段
一般是根據原始質粒資訊確定克隆方案，有以下兩種手段。
1）如果原始質粒與載體有匹配酶切位點，採用相應的內切酶切下相應片段，回收並連線到載體，酶切，並測序鑑定
2）如果沒有匹配的酶切位點，則設計帶有特殊接頭的引物進行PCR擴增，得到目的片段，採用相應的內切酶切下相應片段，回收並連線到穿梭載體，酶切，並測序鑑定
- 質粒載體
1）概念
能夠進行自主複製的環狀DNA雙鏈結構，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸(DNA)分子
2）特徵
質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那黴素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為遊離於染色體外的DNA分子。質粒在宿主細胞體內外都可複製。透過個些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構建在質粒中，透過轉化入大腸桿菌中，利用選擇培養基來篩選從而不斷的複製，來得到目的產物。
2、質粒DNA在大腸桿菌裡轉化
連線上目的基因的質粒轉化大腸桿菌是為了讓目的基因在大腸桿菌裡擴增，然後提取質粒，以下是質粒DNA在大腸桿菌裡轉化的三步驟。
- 大腸桿菌感受態細胞的製備
1）從大腸桿菌平板上挑取一個單菌落於3mlLB培養基的試管中，37℃振盪培養過夜。
2）取0.4ml菌液轉接到40mlLB液體培養基中，37℃振盪培養2~3h
3）菌液轉移到50ml離心管中，冰上放置10min
4）4℃離心10min（4000r/min）
5）倒出培養液，將管口倒置以便培養液流盡
6）用冰浴的0.1mol/L氯化鈣10ml懸浮細胞沉澱，立即冰浴30min
7）4℃離心10min（4000r/min）
8）倒出上清液，用冰浴的0.1mol/L氯化鈣2ml懸浮細胞（冰上放置）
9）分裝細胞，200ul一份，4℃儲存
- 質粒DNA的轉化
1）取200ul新鮮製備的感受態細胞，加入質粒DNA2ul混勻，冰浴30min
2）離心管放到42℃保溫90s
3）冰浴2min
4）每管加800ulLB液體培養基，37℃培養1h（150r/min）
5）取適當體積（100ul）的復甦細胞，塗布在選擇性培養基上，正置30min
6）倒置平皿37℃，12~16h，出現菌落
- 質粒提取步驟
1）取1~4ml在LB培養基中培養過夜的菌液，12000轉離心1min，棄上清
2）加250ul溶液Ⅰ/RNaseA（溶液Ⅰ為細胞懸浮液）混合液，漩渦劇烈振盪直至菌體完全重新懸浮，室溫靜置1-2min。
3）加入250ul溶液Ⅱ（細胞裂解液），輕柔的反覆顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
4）加入350ul溶液Ⅲ（中和液），立刻輕柔地反覆顛倒混勻5-6次，此時會出現白色絮狀沉澱。
5）12000室溫離心10min，收集上清。
6）將上清置於DNA純化柱中，靜置1-2min。
7）12000轉離心1min，棄濾液。
8）加入500ul溶液PB（洗滌液）12000轉離心1min，棄濾液，目的是將矽膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質洗脫，以獲得高質量質粒DNA。
9）加入500ul溶液W（去鹽液），12000轉離心1min，棄濾液，重複一次。
10）12000轉離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。
11）將DNA純化柱置於新的離心管中，懸浮滴加50-100ul溶液Eluent（為無菌的雙蒸水，PH為8.0-8.5），室溫放置2min。
12）12000轉離心1min，此時管底即為高純度的質粒DNA，質粒於-20℃儲存。
質粒提取步驟：吸取液體培養基於1.5ml離心管中12000轉離心1min，棄上清，吸取培養基重複離心棄上清離心，留取少量菌液作為菌種儲存，可直接置於-20℃——加250ulBufferS1懸浮細菌，懸浮均勻——加250ulBufferS2溫和充分的上下翻轉4-6次混合均勻，使菌體裂解——加350ulBufferS3溫和上下翻轉12000離心10min——取上清液轉移到專用的製備管（2ml）12000轉離心1min，棄濾液——加500ulBufferW112000轉離心1min，棄濾液——加500ulBufferW212000轉離心1min，棄濾液，重複一遍——將製備管置回2ml離心管12000轉離心1min——將製備管移入新的1.5ml離心管中，加60~80ulEluent或離子水，室溫1min12000轉離心1min——移去製備管，將有質粒的離心管於4℃或是-20℃儲存
