原創 張 群等 南京林業大學學報
論文推薦
白樺BpGRAS1 基因的克隆及耐鹽功能分析
張 群，及曉宇，賀子航，王智博，田增智，王 超*
林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)。
鹽脅迫是不利於植物生長和發育的主要非生物脅迫之一,處於逆境中的植物其生長髮育會受到不同程度的影響,嚴重時甚至導致植物死亡。為了減少這些條件的不利影響,植物已經進化出多方面的策略,包括形態、生理和生化適應。在對各種非生物脅迫的響應和適應過程中,誘導了許多與脅迫相關的基因,並且積累了多種與脅迫抗性相關的功能蛋白。因此,瞭解鹽脅迫響應的生物分子基礎和耐受機制對於植物耐鹽育種和基因工程非常重要。
GRAS蛋白是植物轉錄因子( transcription factor , TF)的一個重要家族,GRAS家族的名字源於3個最初發現分離出來的成員GAI [ GA (CIB-BERELLIC ACID )INSENSITIVE]、RGA (REPRESSOROFGAI)和 SCR ( SCARECROW)。GRAS在調控植物生長、發育和脅迫反應中發揮重要作用。該蛋白一般由400 ~800個氨基酸殘基組成,其C端高度保守,N端為高度變異區,該蛋白家族的成員具有其特有的GRAS結構域,該結構與植物的抗逆機制有著密切的聯絡,其中部分成員還具有DELLA蛋白結構。DELLA蛋白不僅是縱向根系生長抑制因子,而且還是皮層徑向細胞擴張的積極調節因子,在調控植物根冠發育中發揮著極其重要的作用,可以提高植物對非生物脅迫的抗性。研究表明,GRAS轉錄因子參與了植物生長髮育及形態建成(如赤黴素訊號轉導、根的發育、分生組織的形成),以及植物抗病性和非生物脅迫反應。
近些年來陸續有不同植物種的GRAS轉錄因子家族被鑑定出來,CRAS家族全基因組分析顯示:梅花( Armeniaca mume)中有46個GRAS基因,白菜(Brassica pekinensis )中有48個,楊樹(Populus spp.)中有106個，葡萄(Vitisvinifera)中有52個;甘藍型油菜（ Brassicanapus)基因組中87個GRAS基因分屬13個亞家族,有24 個BnGRAS基因在根部高特異性表達;番茄( Lycopersicon esculentum)中有53個CRAS家族成員;水稻(Oryza sativa L.)中至少有57個GRAS基因 ;SHR也是一種GRAS轉錄因子,在毛果楊(Populus trichocarpa)中鑑定出3個SHR樣基因,在茶樹( Camellia sinensis)中鑑定出52個編碼GRAS蛋白的CsGRAS基因。目前已經發現和鑑定了多種非生物脅迫應答的GRAS轉錄因子。
此外,透過各種分子生物學實驗也證實了GRAS轉錄因子在植物抗逆方面的調控作用。BrLAS編碼一種乾旱反應型GRAS轉錄因子，BrLAS主要參與ABA介導的訊號傳導途徑,其過表達的擬南芥( Arabidopsis thaliana)在營養生長期和生殖生長期表現出對外源ABA 的超敏和多效性,對植物的耐旱性有積極的調節作用。山葡萄(Vitis amurensis ) PAT，作為一個受脅迫誘導的CRAS基因,透過調控一系列抗逆相關基因的表達,增強了過表達轉基因擬南芥的耐寒、耐旱和耐鹽能力。OsGRAS23過表達水稻表現出極高的抗旱性和抗氧化性。SJGRAS40 能夠調控西紅柿的抗旱,耐鹽能力,透過調節葉片的氣孔縮小,從而保留了更多的水分。JrCRAS能夠特異性結合Dof元件,以改善JGRAS的高溫應激反應,在一定程度上控制了HSPs的表達,提高核桃耐高溫能力。GRAS基因在鐵皮石斛( Dendrobium catenatum)的不同組織中廣泛分佈並表達,透過鑑定發現有8個基因經受高溫和鹽脅迫後在不同組織中表達上調。利用大麥條紋花葉病毒(BSMV)誘導小麥(Triticum aestivum ) TaSCL14基因沉默(VIGS) ,發現TaSCL14的沉默導致植株生長受到抑制,光合能力下降,對光氧化脅迫的耐受性降低。以上研究僅僅鑑定出GRAS對非生物脅迫有響應,對其抗逆調控機制研究較少。在擬南芥、水稻的全基因組分析較為透徹,且多為某一亞族分支的相關性研究為主。
白樺( Betula platyphylla)在我國東北地區廣泛存在,因其對環境適應能力強、生長迅速,具有重要的生態﹑觀賞和應用價值等特點被列為國家科技計劃研究的重要樹種之一,因此研究其響應非生物脅迫的生物分子基礎和耐受機制具有重要意義。目前,關於白樺響應鹽脅迫的分子機制及耐鹽白樺分子育種開展了一些研究, BpmiR156基因過表達白樺株系與對照株系相比,在鹽脅迫後鹽害指數增加、生長速度變慢﹑膜系統損傷更嚴重,在一定程度上降低了白樺的耐鹽性。而外源TabZIP的表達能夠提高TB4轉基因白樺株系的耐鹽能。張宇等研究發現過表達BpMYB4能使白樺超氧比物歧化酶(SOD)的活性增加,消除植株體內新陳代謝過程中產生的有害物質,進而提高白樺抵禦低溫的能力。關於白樺GRAS家族全面的生物資訊學分析以及逆境脅迫相關性研究還鮮見報道。本期論文推薦的作者透過白樺轉錄組資料，鑑定出一條響應鹽脅迫的GRAS轉錄因子基因,將其命名為BpGRAS1。對BpGRAS1在鹽脅迫下的表達水平及其耐鹽功能進行分析,以期為研究木本植物中GRAS轉錄因子的抗逆分子機制提供基礎理論資料。
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作者簡介
通訊作者
王超，女，1979年10月出生, 林木遺傳育種國家重點實驗室（東北林業大學），教授，博士導師，研究方向：林木遺傳育種,主要從事白樺木材形成分子調控及材性改良基因工程育種研究。
第一作者
張群，女，1996年4月出生，林木遺傳育種國家重點實驗室（東北林業大學）林木基因組學碩士研究生。
關鍵詞：白樺；GRAS轉錄因子；耐鹽性；基因功能；生理途徑
基金專案：中央高校基本科研業務費專項資金專案(2572016DA01)。
引文格式：張群,及曉宇,賀子航,等.白樺BGRASI基因的克隆及耐鹽功能分析[J].南京林業大學學報(自然科學版), 2021 ,45(5):38-46.ZHANG Q,JIl X Y,HE ZH,et al. Cloning and salt tolerance analysis of BpCRAS1 gene in Betula platyphylla[J].Jourmal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition) ,2021,45(5):38-46.DOI：10.12302/j. issn.1000-2006.202010011.
1目的
GRAS轉錄因子是植物特有的轉錄因子家族之一，在植物響應鹽、千旱等非生物脅迫中發揮重要的調控作用。本研究從白樺( Betula platyphylla )中克隆GRAS轉錄因子基因,研究其耐鹽功能，為研究木本植物GRAS轉錄因子的抗逆機制奠定理論基礎。
2方法
在白樺轉錄組資料庫中獲得一個GRAS轉錄因子基因,命名為BpGRAS1 ( GenBank登入號: MN117546.1)。利用生物資訊學進行多序列比對、構建進化樹並分析。分別構建植物過表達( pROK II -BpGRAS1)及抑制表達( pFGC5941-BpGRAS1)載體。利用農桿菌介導高效瞬時遺傳轉化體系獲得BpGRAS1基因瞬時過表達(OE)、抑制表達(IE)及對照(WT)白樺植株。透過實時熒光定量RTPCR(qRT-PCR)技術分析鹽脅迫下OE、IE及WT植株中BpGRAS1基因的表達情況,鑑定轉基因植株中BpGRAS1的表達效率是否響應鹽脅迫。在鹽脅迫下比較了BpGRAS1 基因瞬時過表達、抑制表達及對照白樺植株的電解質滲透率、失水率、丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。
2.1 試驗材料
白樺無性系組培苗由東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室儲存。組培苗培養條件:溫度為25℃，光週期為12 h光照/12 h黑暗。
大腸桿菌(Escherichia coli) Top10、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105、 植物表達載體pROK II、pFGC5941由東北林業大學林木遺傳育種國家重點實驗室儲存。
2.2 研究方法
取4周苗齡白樺幼苗,使用植物總RNA提取試劑盒(百泰克生物技術有限公司,北京)提取白樺的總RNA,並利用TransScript One -Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMIX(全式金生物技術有限公司,北京)反轉錄試劑盒合成第Ⅰ鏈cDNA,作為模板為後續實驗備用。
透過白樺鹽脅迫轉錄組數分析篩選獲得1條差異表達的GRAS基因，命名為BpGRAS1( GenBank number:MN117546.1)。根據基因序列設計引物BpGRAS1-F和 BpGRAS1-R(表1),以白樺cDNA為模板克隆BpGRAS1基因。
▼表 1 試驗所用引物序列
3結果
BpGRAS1基因的開放閱讀框為1 425 bp,編碼474個氨基酸。BpCRAS1具有GRAS家族的序列特徵,在C端的氨基酸序列相似度較高,與AtSHR親緣關係較近。鹽脅迫處理下,BpGRAS1的表達量升高,過表達植株中表達量高於對照,抑制表達植株中表達量低於對照,說明BpGRAS1受鹽脅迫誘導,成功獲得過表達及抑制表達植株。過表達 BpGRAS1基因能降低白樺在鹽脅迫下的電解質滲透率、失水率及MDA的積累,並顯著增強了POD和SOD酶的活性,從而提高轉基因植株的耐鹽性。
3.1 BpGRAS1克隆及其系統進化分析
本研究前期分別以鹽脅迫及水澆灌處理不同時間(3、6、12、24和48 h)白樺為材料構建轉錄組，經DEG分析,獲得了17個響應鹽脅迫的GRAS轉錄因子,選擇其中表達差異最顯著的基因BpGRAS1進行後續實驗。BpGRAS1基因的開放閱讀框為1 425 bp,編碼474個氨基酸。在NCBI 網站上對 BpGRAS1 cDNA 編碼的氨基酸序列進行同源性BLAST搜尋,發現該序列與川黔千金榆( Carpinus fangiana)的相似性最高,為87.31%。對BpGRAS1與其他8個物種的GRAS蛋白相似性進行保守序列分析,結果顯示:BpGRAS1具有GRAS家族的序列特徵,在C端的氨基酸序列相似度較高(圖1)。由40條白樺GRAS蛋白與32條擬南芥GRAS蛋白、6條輻射松CRAS蛋白、20條毛果楊GRAS蛋白構成的進化樹分析結果顯示,可分為8個亞家族,BpGRAS1 與AtSHR蛋白質序列親緣關係較近,同屬於Ⅳ亞家族(圖2)。
▲圖 1 不同物種GRAS蛋白多序列比對
JrGRAS：胡桃Juglans regia( XP_018813105.1 )；PaGRAS：歐洲甜櫻桃Prunus avium(XP_021825482.1 )；CfGRAS：川黔千金榆Carpinus fangiana( KAE8076562.1) ; ZjGRAS ：棗Ziziphus jujuba（XP_015886865.1）；QsGRAS：歐洲栓皮櫟Quercus suber (XP_023909161.1)；MdGRAS：蘋果Malus domestica（XP_008369183.2）; HuGRAS：哥倫比亞錦葵Herrania umbratica (XP_021290978.1)；EgGRAS：大桉Eucalyptus grandis (XP_010047409.1) .
▲圖 2 GRAS系統進化樹分析
3.2 瞬時轉化植株的獲得
對植物表達載體pROK Ⅱ一BpGRAS1進行檢測,結果顯示目標條帶正確擴增,載體構建成功(圖3A)。對植物表達載體pFGC5941一BpGRAS1進行檢測,結果顯示,抑制表達載體構建成功(圖3B)。最終透過測序分析比對,分別儲存菌種備用。
▲圖 3 植物表達載體pROKII-BpGRAS1及pFGC5941- BpGRAS1的構建
A: M. DL5000 Marker; 1. pROKII載體引物單菌落PCR; 2. 基因引物巢式PCR. B: M. DL2000 Marker; 1. pFGC5941cis端載體引物單菌落PCR; 2. cis端基因引物巢式PCR.
透過農桿菌介導的高效瞬時轉化系統,獲得BpCRAS1基因瞬時過表達(OE)、抑制表達(IE)及對照(WT)植株。
3.3 BpGRAS1基因瞬時轉化白樺植株的實時熒光定量PCR檢測結果
對3種植株進行鹽脅迫處理後,實時熒光定量PCR分析結果顯示,在正常條件下,過表達轉基因植株中BpGRAS1的表達量最高,抑制表達植株中表達量最低。鹽脅迫處理後, pROK Ⅱ-BpGRAS1-EHA105植株表達量最高, pFGC5941 -BpGRAS1 -EHA105表達量最低,並且過表達植株中的表達量高於非脅迫處理,抑制表達植株中的表達量低於對照(圖4)。以上結果證實已經獲得了BpGRAS1過表達和抑制表達瞬時轉化白樺植株,可用於後續試驗。
▲圖 4 BpGRAS1基因瞬時轉化白樺植株qRT-PCR檢測
注：P<0.05。下同。
3.4 BpGRAS1基因瞬時表達及對照白樺植株電解質滲透率、失水率及丙二醛含量分析
對轉化植株及野生型對照鹽脅迫下的電解質滲透率測定結果表明:非脅迫條件下,OE、IE和WT植株的相對電導率基本一致;鹽脅迫處理後，WT及E植株的相對電導率數值顯著高於OE植株,且E植株的電解質滲透率數值最高。該結果說明在白樺中過表達BpGRAS1基因可以降低白樺在鹽脅迫下的電解質滲透率,從而保護植物細胞膜結構完整性(圖5A)。
▲圖 5 鹽脅迫下瞬時過表達、抑制表達及對照白樺植株電解質滲透率、失水率及MDA含量分析
瞬時表達以及對照組白樺葉片(3次重複)失水率測定結果顯示:在0.5 h之內抑制表達的失水率高於對照組及過表達植株;在1 ~3 h 內,抑制表達植株與對照組白樺的失水率遠遠高於過表達植株的失水率;在3~4 h 內,過表達植株的失水率仍最低。結果表明，BpGRAS1基因的過表達可以降低植物在鹽脅迫下的失水率,從而增加白樺的抗逆功能(圖5B)。
OE、IE以及WT白樺葉片(3次重複)MDA含量測定結果顯示:1/2 MS培養條件下,OE、IE植株和WT白樺植株的MDA含量基本一致;但在鹽脅迫條件下,OE植株的 MDA含量為最低,E植株的MDA含量最高。由此說明BpGRAS1基因的過表達可以顯著降低白樺在鹽脅迫條件下MDA含量的積累,進而增強其抗逆能力(圖5C)。
3.5 BpGRAS1基因瞬時表達及對照白樺植株POD、SOD酶活分析
對轉化植株及野生型對照鹽脅迫下的POD及SOD酶活性測定結果(圖6)表明,在正常生長條件下, BpGRAS1基因過表達及對照植株的POD活性略高於抑制表達植株的POD值;在鹽脅迫條件下，BpGRAS1基因過表達植株的POD活性明顯高於對照及抑制表達植株。同樣在鹽脅迫條件下,OE植株的SOD的活性明顯高於WT及E植株。該結果表明BpGRAS1基因的過表達增強了POD和SOD的活性,增強其清除溶液中產生的過氧自由活性基團的能力,進而提高了白樺的耐鹽能力。
▲圖 6 鹽脅迫下瞬時OE、IE及WT白樺植株POD、SOD活性分析
4結論
BpGCRAS1基因響應鹽脅迫,過表達BpGRAS1基因降低了鹽脅迫下植株細胞受損程度,透過增強POD和SOD活性提高白樺的耐鹽能力。
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