近年來,靶向測序憑藉成本低、資料利用率高、組合靈活等優勢,在臨床的疾病輔助診斷、治療以及腫瘤基因檢測中發揮出積極的作用。
靶向測序應用場景在哪裡?
突變基因測序
癌症基因測序;遺傳疾病篩查;免疫療法預測等。
病原體/環境
微生物鑑定
16s擴增子測序;耐藥性分析;病毒嵌合人基因組分析等 。
科學研究
基因功能研究。
靶向測序通用的兩條技術路線:雜交捕獲和多重PCR
雜交捕獲是指將基因組打斷為片段後,加入事先設計好的探針,把這些片段“抓”出來,從而達到富集的目的;多重PCR是指在一個體系中進行多個PCR反應,PCR的引物鋪設在感興趣的DNA區域,多輪反應後,目標區域就顯著富集了。多重PCR技術小、快、靈,實驗週期短,但覆蓋範圍較小;雜交捕獲技術流程稍顯繁瑣,同時具有更高的背景噪音,但非常適合超多重靶標檢測。既然兩種方式各有優劣,那我們要如何選擇靶向富集的方法?
從上面的比較可以看出,使用擴增子建庫富集目的DNA的方法在多個方面顯著優於雜交捕獲方式,特別是在起始量低,用時較短和成本較低方面。
擴增子建庫主要是透過多重PCR的方式來實現,多重PCR由Chambehian於1988年提出,隨著測序技術的發展,使對得到的擴增子進行高靈敏度&高解析度的檢測成為了可能,且從傳統的4-5重,幾十重發展到了現在的上千重甚至上萬重的超多重PCR,再輔以二代測序技術,可在遺傳病診斷,腫瘤基因檢測等領域發揮重要作用。
擴增子建庫技術路線
1、標準擴增子建庫流程
標準擴增子建庫流程為在完整模板的基礎上投入多重擴增的Panel進行多重擴增,隨後將得到的擴增子進行引物消化,消化掉多餘的引物二聚體以及兩端引物本身的部分序列,獲得平末端的結構,與接頭連線後形成完整文庫。
2、兩步法擴增子建庫流程
兩輪擴增的方法原理是在基因組基礎上,投入的多重擴增的引物帶有一定的修飾,經過第一輪多重擴增之後,序列兩端帶有一段接頭序列,第二輪擴增將Index新增上去,經過兩輪擴增形成完整文庫。
3、多重PCR產物擴增子建庫流程
多重PCR產物擴增子建庫原理是在待測基因組上投入無修飾的多重擴增引物進行多重PCR,產物經過純化後,進行常規DNA建庫。