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來源：知識分子
作者：周峰泉
如何採取負責任的態度和措施，保證科學的純潔和廉正？| 圖源：pixabay.com
編者按
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最近，相繼出現的兩篇文章對簡單的敲除或者表達某個基因可以讓某些細胞轉變成神經元提出質疑。這給如火如荼的神經再生領域潑了盆涼水，不僅引發激烈辯論，同時也給神經退行疾病的治療前景蒙上了一層陰影。
由於聲稱有希望治療一些神經退行病變，如帕金森病、青光眼等，神經再生的研究進展得以 “出圈” 受到民眾和投資者的關注。同時，因為脊髓損傷和再生領域，面臨的問題難度大而且實驗相對複雜，經常出現聲稱的 “突破性發現”，讓人真假莫辨。
如何採取負責任的態度和措施，保證科學的純潔和廉正？本刊邀請到約翰·霍普金斯大學醫學院教授周峰泉對神經再生領域進行深入的評述並輔以詳實的案例展示，他認為，在科研中，面對不同的結果，裝作漠不關心是錯誤且缺乏遠見的。
撰文｜周峰泉 錢誠
責編｜邸利會
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據世界衛生組織統計，截至2007年，全球每6人之中就有1人罹患某類神經系統疾病。隨著各國步入老齡化社會，神經系統疾病，特別是與衰老相關的神經退行病變勢必影響越來越多的人。
阿爾茲海默、帕金森、青光眼、黃斑退行性病變，漸凍人（肌萎縮性脊髓側索硬化症）已為人們熟知；此外還有中風，腦外傷，脊髓損傷等急性病變，糖尿病或者腫瘤放化療造成的誘發型神經損傷等等。
然而，殘酷的是，這些疾病，目前卻沒有任何有效的治療方案和方法。為什麼這麼難呢？
1 成人中樞神經系統沒有自然再生能力
神經系統透過傳導電訊號實現認知思考，調配運動，感受世界。除去大量的輔助細胞，負責最主要傳導工作的是神經細胞，也叫神經元。
除了細胞體，神經細胞還有一根修長的軸突用以傳導訊號。神經細胞的軸突可以彙集成束，綿延很長的距離。軸突可以很長，但它和細胞體是貫通的，仍然是一個細胞，這意味著神經細胞內部出現問題繼而死亡，受到外部創傷，受到不利細胞外環境和周圍細胞影響的機率顯著增加。
恰恰不幸的是，不同於其它某些組織（比如面板），成年人類的中樞神經系統沒有自然再生能力，鮮有自發地從幹細胞產生新的神經細胞，受損的軸突又不能自發重新生長回到原有目標。也就是說，中樞神經不僅僅只會越用越少，而且一旦出現問題往往是惡性迴圈，加速退變。
是什麼誘發了中樞神經疾病？毫無疑問，衰老是一個綜合且重要的因素。這可以是神經細胞內部問題導致的（比如細胞器功能障礙，細胞代謝負擔加重，整體上基因表達平衡和染色質穩定性出現了變化等等），也可以是外部因素，或者內外因素髮生了複雜的動態過程（比如長期的炎症反應等等）。
需要強調的是，各類中樞神經系統疾病共通的結局，無一例外經歷了漸進的軸突損失和最終不可逆轉的神經細胞死亡，這也是這些疾病能夠造成不可逆功能障礙的根本原因。比如，急性外傷或者腦中風可以迅速造成大量神經細胞死亡。大多數慢性退行性病變均顯示出不同腦區神經軸突和細胞或多或少，或快或慢的數量減少。
2 來自斑馬魚視網膜的啟發
雙眼的位置雖然存在於大腦之外，但視神經自眼球起始向腦內區域投射，從譜系特質與髓鞘外環境來看，視網膜內神經細胞屬於中樞類別。
同樣，人類視網膜神經細胞不存在自發再生，很多視覺功能障礙也源自衰老，退行病變與外損傷造成的神經細胞損失。
青光眼是人類頭號致盲因素，是一種不可逆疾病。高眼壓或者視網膜神經細胞對於眼壓的敏感是青光眼的顯著標志，也是造成視網膜神經節細胞和視神經死亡的主要原因之一。據統計，青光眼的病理程序可以透過降低眼壓30-50%來阻斷。
除了青光眼這類眼科疾病，源於眼球與大腦透過視神經的這種直接聯絡，新研究顯示，眼部有望作為視窗來進行老年痴呆症和帕金森症的早期診斷——眼部的位置很有利於觀察和非手術型接觸。科研人員對這種策略寄予了很大希望。
非常有趣的是，與人眼不同，斑馬魚的視網膜乃至整個眼球在受到損傷之後可以自發完全組織再生。這源於斑馬魚穆勒膠質細胞（Müller cells）感應損傷刺激後退分化到類似於視網膜前體細胞的狀態，遷移到視網膜各層，重新分化產生神經節神經元、視錐、視杆細胞、雙極細胞等等。
沿進化樹看，禽類還部分保有這種神奇功能，幼年禽類的視網膜可以一定程度上自發再生。可高等哺乳動物，特別是人類成熟的神經系統就完全丟失了這種能力。
這一方面提示可以透過探索斑馬魚視網膜的奧秘，推動再生醫學和製藥進展；另一方面也暗示，出於人類神經系統的體量和複雜程度，自然再生這個功能，想必會造成一些新的無序的神經聯結，可能是隨進化被捨棄掉的。
3 中樞神經再生，我們準備好了嗎？
之前一些比較傳統的治療方案，旨在緩解一些神經紊亂的症狀，或者依賴某種原理減慢與阻斷神經病變程序，但是這些方法都無法填補顯著減少的神經數量。
近年來，細胞重程式設計獲得蓬勃發展。通俗地講，重程式設計就是人為操縱某種細胞進行譜系變換，轉變到另一種細胞的身份、狀態，並且執行功能。
細胞重程式設計給再生醫學提供了新的理論基礎。如今，中樞神經再生主要有3個策略。
第一種是幹細胞移植，就是將多能幹細胞分化成新生神經從而填補損失的神經細胞。
第二種是膠質細胞轉分化，就是將存在於神經細胞減少的腦區，或者視網膜之中高丰度的其它型別細胞直接在組織原位身份轉換成為新的神經細胞，比如大腦中的星形膠質細胞或者視網膜中的穆勒膠質細胞，等等。
膠質細胞轉分化的策略有很多優勢，比如無需大型手術，膠質細胞理論上在損傷和人為操控的情況下能夠先分裂增殖，這樣既能填補顯著減少的神經細胞，又能維持膠質細胞本身的輔助功能。所以細胞轉分化理論上確實是個很不錯的理想途徑。
第三種策略是施用轉基因或者藥物，儘可能將受損的原有神經細胞保護下來，再促使這些損傷神經細胞本身的軸突重新延伸出去與目標連線。
值得強調的是，在上述三種程序的中後期，不管是新生出來的神經細胞，還是保護下來的原有神經細胞，都必須經歷快速地遠距離軸突延伸，體內路線探尋，髓鞘再生和突觸再形成——這才具備了神經功能恢復的生理結構基礎。
基於當前人類科技，很難想象上述一系列歷程可以被單基因或者單種藥物操控。
同樣，不像胚胎髮育時期的體量，成年人類中樞神經的距離和各類成年時期細胞外環境，也勢必給行進的軸突前沿帶來巨大的未知性和阻撓。
頗具代表性的，上調NeuroD1基因經歷了很多體外細胞實驗的論證，顯示這種操控有能力將膠質細胞轉換成為神經元細胞。自然而然，多個實驗室開展了小鼠體內實驗，並且報道高表達NeuroD1可以將皮層或者紋狀體星形膠質細胞轉換成新生神經細胞，存在有效的軸突再投射和神經功能恢復。
另一個最近比較熱門的研究是下調Ptbp1基因實現膠質細胞-神經元細胞轉分化，例如在紋狀體敲降Ptbp1與上調NeuroD1基因有類似的轉分化效果。在小鼠視網膜敲降Ptbp1則獲得了比較複雜的結果，有的實驗室發現穆勒膠質細胞被轉分化變成視神經節神經元和雙極細胞，有的實驗室發現穆勒膠質細胞被轉分化變成了視錐細胞。
然而，最近登刊的幾篇文章再次考察了上述結論，並得出了否定的結果。
德州大學西南醫學中心的張春立教授實驗室在Cell 發文，用小鼠體內實驗，透過譜系追蹤發現在皮層或者紋狀體的星形膠質細胞特異性高表達NeuroD1或者敲降Ptbp1，均無法成功轉分化成為神經元細胞。
他們認為，其它實驗室先前發表的研究結果可能是因為一種特殊的實驗假象而造成錯誤的解讀。
具體來說，張春立教授實驗室的研究結果表明，原來大家經常用來在膠質細胞中特異性表達NeuroD1基因或者敲低Ptbp1基因的病毒載體AAV-GFAP啟動子喪失膠質細胞特異性，而錯誤地標記了舊的原有神經元細胞。是什麼原因造成的特異性丟失目前尚不清楚，有人質疑可能是因為實驗中所用的病毒滴度太高。
但近期，約翰斯-霍普金斯醫學院的Seth Blackshaw教授實驗室，利用遺傳譜系示蹤和單細胞測序譜系追蹤，透過傳統基因敲除方法（不涉及使用病毒）明確地展示了去除Ptbp1無法將視網膜的穆勒膠質細胞，或者皮層、紋狀體的星形膠質細胞轉變成神經元。
我們希望這些不同的研究結果可以透過正常交流、合作，以及其它實驗室的獨立重複實驗得到解決，畢竟，科學研究的終極目標是去偽存真，造福人類。
4 如何解決科研的爭議？
在科學研究中，同樣的研究得到不同的結果是很正常而且普遍的。生命科學目前還停留在實驗科學階段，由於實驗條件、樣品、動物、儀器裝置、實驗技術略有不同而得到完全不一樣的結果，也不意外。
那麼，如果遇到這種情況怎麼解決呢？是互相指責，爭論，還是裝作漠不關心——反正文章已經發了，榮譽、經費也到手了，實驗結果的對錯，有什麼關係呢？其實，這樣的態度和解決問題的方法是錯誤且缺乏遠見的。
從個人事業看，這種做法會損傷一個人在其學術領域內的名聲和信譽；如果是作為導師，還會誤導學生在未來學術發展的判斷力甚至傷害他們的人生觀。
從社會的角度上看，如果利用錯誤的實驗結果獲得風險投資並針對疾病開發治療藥物，則是對寶貴社會資源的巨大浪費。
針對學術爭議，目前學術界廣泛認可的做法一般有三種：
一是實驗室自我更正；二是得出不同結果的實驗室相互交流並找出問題所在；第三種是由獨立第三方的一個或多個實驗室儘量按照同樣的實驗條件進行重複。
我想提及幾個在神經損傷、修復和再生領域的故事， 也許大家可以思考並判斷哪種做法最為合適。
第一個故事是關於脊髓再生研究中的一個重要發現，我作為旁觀者親身參與了故事的開端。
眾所周知，成年哺乳動物中樞神經損傷以後無法再生，所以人們在車禍或者體育運動過程中脊髓損傷後的主要症狀就是半身癱瘓，目前基本上沒有治療手段。
在上世紀90年代，瑞士的 Martin Schwab 實驗室發現，在中樞神經系統中的一類神經膠質細胞裡可能存在抑制神經再生的蛋白。他們用這種含有這種蛋白的提取物作為抗原，研製開發了一個名稱為IN-1的單克隆抗體。當把生產這個抗體的細胞移植到脊髓損傷的小鼠體內，他們發現小鼠的神經再生能力增強了，甚至有一些功能性的恢復 [1, 2]。
一個重要的問題就是，這個IN-1抗體的抗原到底是哪個蛋白質？2000年，在 Nature 雜誌上同時有三篇文章報道了這個抗體的抗原是一個叫Nogo的蛋白質。那麼如果能在小鼠中把這個編碼Nogo的基因去掉，是不是小鼠脊髓損傷後再生能力就會增加呢？
大概是在2002年，也是我做博士後的第2年，有一篇關於Nogo基因敲除後脊髓再生研究的文章送到了我博後導師手裡進行審稿，準備在Cell 雜誌發表。來自耶魯大學實驗室的研究發現，Nogo基因敲除小鼠脊髓損傷以後有非常明顯的神經纖維再生現象，而且有顯著的運動功能恢復。
當時，大家一致認為這是神經再生領域的一個突破性發現，應該得以發表。但是有趣的是，在我們的審稿意見還沒有返還給雜誌編輯之前，Cell 雜誌社又送來了另一篇來自於斯坦福大學的研究文章，同樣也做了一個Nogo基因敲除小鼠模型，卻發現這個小鼠在脊髓損傷以後沒有看到明顯的神經再生。這與耶魯大學的結論正好相反。
作為審稿人，我們無法判斷到底誰的結論是正確的，因此我們當時的意見就是希望這兩個實驗室能夠相互溝通，然後找到得到不同結論的原因。
這個故事的結局是什麼呢？
據說，耶魯和斯坦福兩個實驗室進行了一些討論和交流，而且互相交換了各自做出來的Nogo基因敲除小鼠。來自斯坦福的研究堅持了原來的結論，認為在敲除Nogo基因後小鼠脊髓再生並沒有得到增強。而來自耶魯大學的研究者發現他們實驗中有幾隻年紀比較大的小鼠沒有看到很好的神經再生現象，因此認為敲除Nogo基因可以促進年青小鼠的神經再生和功能恢復。最終這兩篇文章並沒有發表在Cell 雜誌上，而是2003年同時發表在Neuron 雜誌上 [3, 4]。在同一期雜誌裡還發表了另一篇來自瑞士 Martin Schwab 實驗室的研究 [5]，其結論與耶魯大學研究基本一致。
當然故事到此並沒有結束。
後來，斯坦福大學研究者用來自耶魯大學的老鼠重複了他們的實驗。他們發現如果在實驗最後一步使用熒光染料標記再生神經纖維的時候發生洩漏，會觀察到脊髓損傷遠端有許多類似再生的神經纖維，因此推測耶魯大學實驗室看到的神經再生也許是熒光染料洩露造成的 [6]。
2005年，斯坦福大學實驗室又在PNAS 雜誌上發文表明，基因敲除編碼Nogo蛋白的受體的基因也不能促進小鼠脊髓損傷後的神經再生 [7]。2010年斯坦福大學文章的第一作者在加州大學聖地亞哥分校自己實驗室發表論文證明，同時敲除包括Nogo在內的三個編碼神經再生抑制蛋白的基因也無法促進小鼠脊髓再生 [8]。
目前神經再生領域內的一致觀點是，單純敲除某一類再生抑制基因並不能有效促進中樞神經系統神經再生——
首先，神經系統內目前至少有三大類神經再生抑制蛋白，而Nogo蛋白只代表其中一類；其次，成年哺乳動物中樞神經元喪失了神經再生的內源動力，因此即使在外部環境允許的條件下也不能有效再生。
第二個故事也與脊髓損傷再生相關。
在脊椎損傷後，除了斷掉的神經纖維重新生長，另外一個辦法就是將神經幹細胞移植到損傷的脊髓內，並讓它們分化為神經元從而進行功能修復。
2012年，加州大學聖地亞哥分校的一個神經再生實驗室在Cell 雜誌上發表文章，報道了一項重大進展 [9]。他們發現，移植到損傷的脊髓內神經幹細胞透過各種細胞生長因子刺激可以成功分化為神經元並向頭尾兩端長出很長的神經纖維。最重要的是，這些新長出來的神經纖維就可以作為一個橋樑在損傷處連線上下兩端原有的神經組織，從而部分修復脊髓損傷造成的運動功能喪失。
這一研究結果得到了神經再生領域內的所有科研人員的密切關注。那麼，結果是否確實可靠，可以重複實現呢？
加州大學爾灣分校的一個實驗室按照這篇文章的具體方法重複了這一實驗 [10]。他們重複的結果發現，移植的神經幹細胞的確能分化為神經元並長出神經纖維。但是這些新神經元及其纖維卻不能和脊髓內原有的神經組織形成功能性連線，所以沒有觀察到任何運動功能恢復。
雖然我們不知道為什麼兩組實驗結果不一樣，但是起碼錶明對於任何實驗手段相對複雜且結果很好的研究不能盲目相信，要有存疑的概念。
第三個故事是關於如何透過細胞移植修復由視網膜感光細胞（視杆和視錐兩種感光細胞）退化或死亡而導致的失明。
倫敦大學學院眼科學系 Robin Ali 教授實驗室在此研究領域於2006年和2012年在Nature 雜誌上發表了兩篇相關文章 [11,12]。他們發現，如果將初步分化的視杆前體細胞移植到成年小鼠正在退化的視網膜裡，這些前體細胞會整合到原有的視網膜中並分化成有功能的視杆細胞，從而修復視覺功能。
許多其他實驗室用類似的方法也得到了相同的結果。因此領域內一致認為，這是一個有臨床應用前景的方法。
但是，在2016年 Robin Ali 教授實驗室經過一系列實驗發現，前面這些研究中普遍認為來源於移植細胞的有功能的視杆細胞其實是原視網膜裡已經喪失功能的宿主細胞 [13]。
那麼這些舊的視杆細胞是如何恢復功能並同時擁有移植細胞特異標記的熒光蛋白的呢？真正的原因是透過細胞與細胞間的細胞質交換。帶有熒光蛋白標記的移植細胞透過細胞質交換可以把蛋白質和信使RNA轉移給原來的宿主細胞。如果轉移的細胞質中含有損傷/疾病中宿主細胞缺少的功能蛋白質, 如peripherin-2和rhodopsin等，那麼這些宿主細胞就會重新恢復功能。
同年另一篇研究文章 [14] 也發現了同樣的移植-宿主細胞間的細胞質交換。
雖然後面的研究從表面上看好像是推翻了從前的研究結論，但實際上細胞質交換有可能是一種更好更有效的修復視網膜感光細胞功能的方法。
當然為了更好的保證科學研究的準確性和可重複性， 需要各方面的共同努力，包括科學研究人員自己和科研經費管理部門。
前兩個故事都在脊髓損傷和再生領域，由於面臨的問題難度大而且實驗相對複雜並涉及到大量活體動物實驗，該領域經常有 “突破性發現”，但實際上許多發表的文章難以讓人信服。
因此，2014年由美國邁阿密大學醫學院脊髓再生研究中心的幾位專家牽頭，聯合全世界幾十個從事神經再生研究的實驗室，發表了一篇文章 [15]，其中明確而詳細列地建議了今後在發表脊髓損傷與再生研究的文章中必須要寫出的一些實驗條件和實驗過程，從而增加該領域科學研究的透明度與可重複性。
另外，美國政府醫藥健康領域的主要經費管理機構NIH曾在2007年專門劃撥了一筆經費資助脊髓損傷和再生研究實驗技術的培訓以及對某些重要發表成果進行獨立重複實驗。
這些都是一些好的 “撥亂反正” 的措施，值得借鑑。
參考文獻：
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製版編輯 |盧卡斯
