一、形態結構和培養特性觀察
１、微生物的形態結構觀察主要是透過染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構（包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性進行觀察，直觀地瞭解細菌在形態結構上特性，根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑑定微生物的目的。
２、細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落（colony）。不同微生物在某種培養基中生長繁殖，所形成的菌落特徵有很大差異，而同一種的細菌在一定條件下，培養特徵卻有一定穩定性。，因此可以對不同微生物加以區別鑑定。因此，微生物培養特性的觀察也是微生物檢驗鑑別中的一項重要內容。
１）細菌的培養特徵包括以下內容：在固體培養基上，觀察菌落大小、形態、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特徵及遷移性等。在液體培養中的表面生長情況（菌膜、環）混濁度及沉澱等。半固體培養基穿刺接種觀察運動、擴散情況。
２）黴菌酵母菌的培養特徵：大多數酵母菌沒有絲狀體，在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似，均勻生長、沉澱或在液麵形成菌膜。黴菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養基裡，菌絲無限伸長沿培養基表面蔓延。黴菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青黴菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內菌絲褐色。黴菌在固體培養表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。
二、生理生化試驗
微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物，生化反應常用來鑑別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑑定中的重要依據之一。
微生物檢驗中常用的生化反應有：
1、尿素酶（Urease）試驗
有些細菌能產生尿素酶，將尿素分解、產生2個分子的氨，使培養基變為鹼性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶，因為不論底物尿素是否存在，細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。
試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物大量接種於液體培養基管中，搖均，於36±1℃培養10，60和120min，分別觀察結果。或塗布並穿刺接種於瓊脂斜面，不要到達底部，留底部作變色對照。培養2，4和24h分別觀察結果，如陰性應繼續培養至4天，作最終判定，變為粉紅色為陽性。
2、氧化酶（Oxidase）試驗
氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素C氧化，然後此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。
試驗方法：在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色，Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應在數分鐘內判定試驗結果。
注意事項：
（1） 鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應裝在棕色瓶中，並在冰箱內儲存，如溶液變為紅褐色，即不宜使用。
（2） 鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對苯撐二胺呈紅色反應，若用它來挑取菌苔，會出現假陽性，故必須用白金絲或玻璃棒（或牙籤）來挑取菌苔。
（3） 在濾紙上滴加試劑，以剛剛打溼濾紙為宜，如濾紙過溼，會防礙空氣與菌苔接觸，從而延長了反應時間，造成假陰性。
3、過氧化氫酶的測定
過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。
1． 試劑：3－10％過氧化氫（H2O2）
2． 菌種培養：將測試菌種接種於合適的培養基斜面上，適溫培養18－24h。
3． 試驗方法：取一干淨的載波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2，挑取1環培養18－24h的菌苔，在H2O2溶液中塗抹，若有氣泡（氧氣）出現，則為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上，觀察氣泡的產生。
4． 注意事項：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培養基不可含有血紅素或紅血球。
4、甲基紅（Methyl Red）試驗
腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸，進一步分解中，由於糖代謝的途徑不同，可產生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物，可使培養基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法：挑取新的待試純培養物少許，接種於MR－VP生化鑑定管，於36通用培養基，培養於36±1°C或30°C（以30°C較好）3~5天，從第二天起，每日取培養液1ml，加甲基紅指示劑1~2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。
甲基紅為酸性指示劑，pH範圍為4.4~6.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而增強黃色，在pH5.0以上，則隨鹼度而增強黃色，在pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，此時應延長培養時間，重複試驗。
5、V-P試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白腖水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙醯甲基甲醇，後者在強鹼環境下，被空氣中氧氧化為二乙醯，二乙醯與蛋白腖中的胍基生成紅色化合物，稱V－P（+）反應。
試驗方法：
１）O’Meara氏法：將試驗菌接種於通用培養基，於36±1°C培養48h，培養液1ml加O’Meara試劑（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液）1ml，搖動試管1~2min，靜置於室溫或36±1°C恆溫箱，若4h內不呈現伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h後判定結果者。
２）Barritt氏法：將試驗菌接種於通用培養基，於36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動2~5min，陽性菌常立即呈現紅色，若無紅色出現，靜置於室溫或36±1°C恆溫箱，如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。
３）快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放於小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環，乳化接種於其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動後放置5min，判定結果。不產酸的培養物不能使用。
本試驗一般用於腸桿菌科各菌屬的鑑別。在用於芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時，通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙醯甲基醇的產生，故應省去或以氯化鈉代替。
6、含碳化合物的利用
細菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源，反映該菌是否產生代謝這種化合物的有關酶系，因而作為鑑定依據。測定的基礎培養基配方很多，因種而異。現介紹1種合成的基礎培養基，有些細菌還可適當補加各種維生素。培養基可製成液體，分裝試管，也可製成固體平板。可用於測定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳氫化合物等。糖的含量一般為1％，醇類酚類等的含量一般為0.1－0.2％，氨基酸的含量一般為0.5％。因碳氫化合物不溶於水，可在液體培養基中振盪培養，或加入到45℃的固體培養基中，振盪後立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌後加入已滅菌的基礎培養基中，某些醇類和酚類不必滅菌。
接種和觀察結果：菌種最好做成懸液，避免帶入少量碳源干擾試驗結果。平板培養用接種環點種，液體培養則用直針接種。每一測定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎培養基作對照。
適溫培養2、5、7天后觀察，凡測定菌在有碳水化合物的培養基中生長情況，明顯超過空白培養基的生長量為陽性，否則為陰性。假若兩種培養基上生長情況差別不明顯，開在同一培養基上連續移種3次，如差別仍不明顯則以陰性論。
7、葡萄糖的氧化發酵試驗
在細菌鑑定中，糖類發酵產酸是1項重要依據。細菌對糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發酵產酸，不需要以分子氧作為最終受氫體，稱發酵型產酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產酸。前者包括的菌種型別為多數。氧化型產酸量較少，所產生的酸常常被培養基中的蛋白腖分解時所產生的胺所中和，而不表現產酸。為此，Hugh和Leifson提出一種含有低有機氮的培養基，用以鑑定細菌從糖類產酸是屬氧化型產酸或發酵型產酸。這一試驗廣泛用於細菌鑑定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎培養基來測定細菌從其他糖類或醇類產酸的能力。
（1）接種 ：以18－24h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培養基中，每株菌接4管，其中2管用油封蓋（凡士林：液體石蠟＝1：1混合後滅菌），約加0.5－1釐米厚，以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開管，同時還要有不接種的閉管作對照。適溫培養1、2、4、7天觀察結果。
（2）結果觀察：氧化型產酸――僅開管產酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產鹼（1－2d），後來才稍變酸。發酵型產酸則開管及閉管均產酸，如產氣，則在瓊脂柱內產生氣泡。
8、糖或醇類發酵試驗
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異，或能利用或不能利用，能利用者，或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。
試驗方法：以無菌操作，用接種針或環移取純培養物少許，接種於發酵液體培養基管，若為半固體培養基，則用接種針作穿刺接種。接種後，置36±1.0°C培養，每天觀察結果，檢視培養基顏色有無改變（產酸），小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產氣陽性，若為半固體培養基，則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若有動力、培養物可呈彌散生長。
本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力，從而進行各種細菌的鑑別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫，溴百里藍和An-drade指示劑。
注：對於糖醇類發酵現在一般用糖、醇類細菌微量生化鑑定管在36℃18－24h即可出結果。
9、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗
有些細菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。
試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（α－萘胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加於液體培養物或瓊脂斜面培養物表面，立即或於10min內呈現紅色即為試驗陽性，若無紅色出現則為陰性。
用α-萘胺進行試驗時，陽性紅色消退很快、故加入後應立即判定結果。進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應加註意。
10、靛基質（Imdole）試驗
某些細菌能分解蛋白腖中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合，形成玫瑰吲哚，為紅色化合物。
試驗方法：將待試純培養物小量接種於試驗培養基管，於36±1C培養24h時後，取約2ml培養液，加入Kovacs氏試劑2~3滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質，待其浮於培養液表面後，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。
實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應，若先用二甲苯或乙醚等進行提取，再加試劑，則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色，因而結果更為可靠。
11、三糖鐵（TSI）瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物，穿刺接種並塗布於斜面，置36±1℃培養18~24h，觀察結果。
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣（變黃）；產生硫化氫（變黑）。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細菌利用培養基中含氮物質，生成鹼性產物，故使斜面後來又變紅，底部由於是在厭氧狀態下，酸類不被氧化，所以仍保持黃色。
12、氨基酸脫羧酶的測定
有些細菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反應在偏酸的條件下進行。當培養基含胺類時呈鹼性反應，使指示劑變色。
接種與觀察結果：用幼齡培養液作為菌種，直接接種。接種後封油，對照管與測定管同時接種封油。腸肝菌科的細菌於37℃培養4天觀察。當指示劑呈紫色或帶紅色調的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對照管應呈黃色反應。
13、硫化氫（H2S）試驗
有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉澱物。
試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中，沿管壁穿刺接種，於36±1℃培養24~28h，培養基呈黑色為陽性。陰性應繼續培養至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種於一般營養肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛於培養基上空，以不會被濺溼為適度；用管塞壓住置36±1℃培養1~6天。紙條變黑為陽性。
14、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用
某些細菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，則培養基中由於有遊離鈉離子存在而呈鹼性。
接種與觀察結果：取幼齡菌種接種於斜面上，適溫培養3－7天，培養基呈鹼性（藍色）者為陽性反應，不變者則為陰性。
15、利用丙二酸鹽試驗
丙二酸鹽是三羧酸迴圈中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細菌鑑定中的一個鑑別性特徵。
許多微生物代謝有三羧酸迴圈，而琥珀酸脫氫是三羧酸迴圈的一個環節，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被佔據，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應，抑制了三羧酸迴圈。
接種和觀察結果：
用幼齡菌種接種測定培養基和空白培養基，於適溫培養1－2d，觀察培養基變色情況。
如測定培養基生長並變藍色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結果。反之，如測定培養基未變色，而空白對照培養基生長，則為陰性，即不利用丙二酸鹽。
16、葡萄糖酸鹽的氧化
假單胞菌屬和腸道桿菌科的細菌，可氧化葡萄糖酸為2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸無還原性基團，氧化後形成酮基，則可將斐林氏試劑的呈藍色的銅鹽還原為磚紅色的Cu2O沉澱。
試驗方法：用pH7.2的磷酸緩衝液配製成含1％葡萄糖酸鹽（可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣）的溶液。分裝試管，每管2mL。刮取適溫培養18－24小時的菌苔至2mL的葡萄糖酸鹽溶液中製成濃的菌懸液，置30℃過夜，然後每管加入0.5mL的斐林試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，試管中液體由藍色變為黃綠，綠橙色或出現紅色沉澱者為陽性反應，如溶液不變色者為陰性。
17、硫化氫-靛基質-動力（SIM）瓊脂試驗
試驗方法：以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度，置36±1℃培養18~24h，觀察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然後加Kovacs氏試劑數滴於培養表面，靜置10min，若試劑呈紅色為靛基質陽性。培養基未接種的下部，可作為對照。
本試驗用於腸桿菌科細菌初步生化篩選，與三糖鐵瓊脂等聯合使用可顯著提高篩選功效。
18、β-半乳糖苷酶（ONPG）的測定
本試驗應用於腸肝菌科的鑑定。
測定步驟：
（1） 將測定菌接種於TSI斜面上，培養於37℃18h（或其他最適溫度）
（2） 挑取1大環菌苔入約0.25mL的生理鹽水中製成菌懸液，每管加1滴甲苯，搖勻（有助於酶的釋放），於37℃放置5分鐘。
（3） 在菌懸液中加入0.25mL的0.75mol/L ONPG，測定管置於37℃水浴培養。經30分、1、2、3、……24h進行觀察，如有黃色者則為陽性。
19、耐鹽性試驗
本試驗是觀察滲透壓對細菌生長的影響。由於不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑑別特徵。一般可根據不同種類的菌株，選擇其適合生長的培養基，在其中加入不同量的NaCl，接種後觀察其生長與否，以判斷其耐鹽性。
以肉湯培養液根據鑑定需要，配成不同濃度的NaCl，如2％、3.5％、5％、7％、10％等。培養基要求十分澄清，接種時應採用幼齡菌液，直針接種，適溫培養3－7d，與未接種的對照管對比，目測生長情況。
20、卵磷脂酶的測定
菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽鹼。
接種與觀察結果：將測試菌的菌液，環接在有卵黃的試管和不加卵黃的對照管中，適溫培養1、3或5天觀察。假若與對照管相比較，在卵黃胰腖液中或表面，形成白色沉澱者，則為陽性反應，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽鹼，說明有卵磷酶的存在。
另一種方法：
以無菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當於等量的生理鹽水搖勻後，取10mL卵黃液加入到溶化的約50－55℃的200mL肉汁腖瓊脂培養基中，混合均勻後倒入培養皿，製成卵黃平板，過夜後即可使用。
接種與觀察結果：將測試菌點接在卵黃平板上，每皿可分散點接4－5株菌、（芽孢桿菌以點接1－2株菌為宜）以不影響結果觀察為度，如測試厭氧菌，則須在上面加蓋無菌的蓋玻片。每株菌至少重複點接兩皿。適溫培養1－2d觀察，在菌落周圍形成乳白色混濁環，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，說明該菌株有卵磷脂酶存在。
21、石蕊牛奶的反應
牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中加入石蕊是作為酸鹼指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時呈淡紫色，酸性時呈粉紅色，鹼性呈藍色，還原時則自上而下地褪色變白。
細菌對牛奶的作用有一下幾種：
（1） 產酸――細菌發酵乳糖產酸，使石蕊變紅。
（2） 產鹼――細菌分解酪蛋白產生鹼性物質，使石蕊變藍。
（3） 腖化――細菌產生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較澄清。
（4） 酸凝固――細菌發酵乳糖產酸，使石蕊變化，當酸度很高時，可使牛奶凝固。
（5） 凝乳酶凝固――有些細菌能產生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時石蕊常呈藍色或不變色。
（6） 還原――細菌生長旺盛，使培養基氧化還原電位降低，因此石蕊還原褪色。
接種與觀察結果：接種待測菌株，適溫培養3、5、7d或14d，按上述特徵觀察和記錄牛奶產酸、產鹼、凝固或腖化等反應。
22、酪素水解試驗（酪蛋白水解）
牛奶平板的製備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中（或用50mL脫脂牛奶），另稱1.5g瓊脂溶於50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至45－50℃時，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使表面水分乾燥，然後將菌種點接在平板上，每皿可點接3－5株菌。適溫培養1、3、5天，記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。
配製該培養基時，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。
23、酪氨酸水解
將L－酪氨酸0.5g懸浮於10mL蒸餾水中，8磅20分鐘滅菌，然後於100mL無菌的營養肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固後，將測試菌接種於平皿上，培養7到14d，記錄酪氨酸結晶是否被水解而變透明。
24、苯丙氨酸脫氨試驗
某些細菌（如變形桿菌）具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化鐵呈藍綠色。本試驗用於腸肝菌科和某些芽孢桿菌屬的鑑定。
接種與觀察結果：將菌種接種於該培養基斜面上，適溫培養3－7d（某些芽孢桿菌須培養21d）。取10％的FeCl3水溶液4－5滴，滴加在生長菌苔的斜面上，當斜面和試劑液麵處呈藍綠色時為陽性反應，表示從苯丙氨酸形成苯丙酮酸。
25、產糊精結晶試驗
某些需氧芽孢桿菌能產生澱粉酶，使澱粉水解為糊精。該反應僅用於區別多粘芽孢菌，浸麻芽孢菌和環狀芽孢菌的培養物。在大試管中（200X20mm）裝碾過的小麥（或燕麥）0.5g，CaCO30.2g，蒸餾水10mL，滅菌後接種，35℃培養3、5和7d後，取1滴盧哥爾氏碘液混勻，乾燥後，用顯微鏡觀察有暗褐色或藍色的六角形結晶的糊精，假若大量形成，則排列為扇形或針狀。
26、從甘油產生二羥基丙酮
本試驗主要是用於區分醋酸單胞菌屬和假單胞菌屬以及某些芽孢桿菌的鑑定。生酮反應是由相應的多元醇的脫氫酶的作用，此反應就是測定有否這些脫氫酶。
接種與觀察結果：融化三角瓶中的培養基，倒成平板，凝固後在平板上劃短線接種，適溫培養10天，在平板上倒入斐林試劑A、B混合液，以覆蓋菌落為度，2小時內檢查，若在菌落周圍出現紅色的暈者為陽性反應。為了能掌握這一試驗，可接種多粘芽孢桿菌作陽性對照。
27、厭氧硝酸鹽產氣
在厭氧情況下，有些好氧細菌，能以硝酸鹽代替分子氧作為受氫體，進行厭氧呼吸，將硝酸鹽還原為氣態氮，即為土壤中的反硝化作用。某些芽孢桿菌，假單胞菌及產鹼菌等屬的細菌具有此反應。
接種封油：以斜面菌種用接種環接種後，用凡士林油（凡士林和液體石蠟為1：1）封管，封油的高度約1釐米。必須同時接種不含有硝酸鉀的肉汁腖培養液作對照。
觀察結果：培養2－7d，觀察在含有硝酸鉀的培養基中有否生長和產生氣泡。如有氣泡產生，表示反硝化作用產生氮氣，為陽性反應。但如不含硝酸鉀的對照培養基也可產生氣泡，則只能按可疑或陰性處理。
28、馬尿酸鹽水解試驗
本試驗作為區分某些芽孢桿菌的鑑定和黃單胞菌屬的鑑定之用。
接種和觀察結果：
以幼齡菌種接種於上述培養液中，適溫培養4周（高溫芽孢菌培養2周），取1mL培養物，和1.5mL50％的；硫酸混合，靜置片刻，在酸性混合物中有針狀結晶出現為陽性，證明從馬尿酸鹽形成安息香酸。
29、對疊氮化鈉的抗性
本試驗用於高溫芽孢桿菌的測定。
接種和觀察結果：
取1環幼齡的菌液，接種於上述培養基中，同時接種營養肉湯作為對照。45℃培養7至14d觀察生長情況。
30、氰化鉀試驗
氰化鉀（KCN）是呼吸鏈末端抑制劑。能否在含有氰化鉀的培養基中生長，是鑑別腸桿菌科各屬常用的特徵之一。
接種和觀察結果：
用幼齡菌種接種於加氰化鉀的測定培養基和未加氰化鉀的空白培養基中，適溫培養1－2d，觀察生長情況。
能在測定培養基上生長者，表示氰化鉀對測定菌無毒害作用，為陽性。若在測定培養基和空白培養基上均不生長，表示空白培養基的營養成分不適於測定菌的生長，必須選用其它合適的培養基。而測定菌在空白培養基上能生長，在含氰化鉀的測定培養基上不生長，為陰性結果。
應該注意：氰化鉀是劇毒藥品，操作時必須小心。培養基用畢，每管加幾粒硫酸亞鐵和0.5mL20％KOH以解毒，然後清洗。
31、對溶菌酶抗性的測定
在100mL的三角瓶中，放入60－65mL無菌的0.01mol/L HCL，在其中加入0.1g溶菌酶，瓶上塞無菌棉花，在小火上煮沸20分鐘後，冷到室溫，加無菌的0.01mol/L HCL不足到100mL。取1mL溶菌酶溶液與99mL無菌的肉湯培養液混合，分裝無菌試管，每管2.5mL，在含有0.001％溶菌酶肉湯管子及無溶菌酶的營養肉湯對照管中，各接種1環菌液，適溫培養5－7d，記錄兩管的生長情況。
32、在pH5.7營養肉湯上的生長
本試驗應用於芽孢桿菌屬中種的鑑定。
接種和觀察結果：
取菌液一環，接種於上述培養基中，同時接種普通肉湯液（7.2pH）作對照。適溫培養1－3d後觀察生長情況。
該培養液要求十分澄清，pH必須準確，最好用pH計調測。
33、需氧性試樣
若在培養基中加入還原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉等，以除去培養基中的氧氣或氧化型物質，使厭氧菌能在有氧情況下生長。
1． 接種與觀察結果：用1小環（外徑1.5毫米的接種環）的肉湯菌液，穿刺接種到上述培養基中，必須穿刺到管底。30℃培養，分別在3至7天觀察結果。如細菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。
34、明膠（Gelatin）液化試驗
有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質而液化。
試驗方法：挑取18~24h待試菌培養物，以較大量穿刺接種於明膠高層約2/3深度或點種於平板培養基。於20~22℃培養7~14天。明膠高層亦可培養於36±1℃。每天觀察結果，若因培養溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固後、再觀察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽性。平板試驗結果的觀察為在培養基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10~20min後，菌落周圍應出現清晰帶環。否則為陰性。
35、澱粉水解試驗
某些細菌可以產生分解澱粉的酶，把澱粉水解為麥芽糖或葡萄糖。澱粉水解後，遇碘不再變藍色。
試驗方法：以18~24h的純培養物，塗布接種於澱粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分割槽接種，試驗數種培養物）或直接移種於澱粉肉湯中，於36±1°C培養24~48h，或於20°培養5天。然後將碘試劑直接滴浸於培養表面，若為液體培養物，則加數滴碘試劑於試管中。立即檢視結果，陽性反應（澱粉被分解）為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。
澱粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結果與菌種產生澱粉酶的能力、培養時間，培養基含有澱粉量和pH等均有一定關係。培養基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。澱粉瓊脂平板不宜保存於冰箱，因而以臨用時製備為妥。
36、生長溫度的測定
細菌生長的最高、最適和最低溫度，常常是某些細菌鑑定的特徵之一。測定細菌的生長溫度，要求培養液十分清晰（如普通肉湯培養液），並採用液體菌種直針接種（不用接種環接種）。放置於恆溫水浴培養。指示溫度計應放在同樣的試管和培養基內，在指定溫度下培養2－5d，觀察生長情況。在接近0℃的低溫培養，則觀察時間可延長至7－10d，甚至30d。
觀察記錄結果：
目測生長情況，與未接種的空白培養基對比，注意混濁度、沉澱物和懸浮物等項，並分級記錄如下：
（1）“＋“：表示生長良好；與對照管相比，可清楚地判定是混濁的。
（2）“＋－“：表示生長差；與對照管相比，只有在某一觀察角度時方能看到明顯的混濁。
（3）“－“：表示不生長；在適宜的角度下觀察，與對照無差異。
總之，培養5d，能生長者均按生長計，否則按不生長計，凡培養5d仍屬可疑者或不生長者必須重測，在重測時，可能出現有時生長，有時不生長的不穩定現象，這可能有兩種原因：一種是水浴溫度不穩定，培養時溫度波動大；另一種原因可能是所測定的溫度，恰好是測定菌的臨界生長溫度，在這種情況下，可用提高一度或降低一度的辦法肯定之。
必須注意，當測定的試管較多時，不可將試管捆成一捆浸於水浴中，這樣捆著的試管內外溫度不一致，易出現誤差。最好用特製試管架放試管，所用溫度計應用標準溫度計標定過。
37、形成芽孢的培養基
形成芽孢是芽孢桿菌的關鍵性特徵，但不是所有的芽孢桿菌都能在任何條件下形成芽孢。在鑑定細菌時，為了確定是否屬芽孢菌，需要對那些在一般條件下不形成芽孢的細菌，採用生孢子培養基，來確定是否能形成芽孢。
38、O/129的敏感性試驗
O/129即2，4－二氨基－6，7－二異丙醇喋啶，為弧菌抑制劑。該試驗用於弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬的鑑定。
取2，4－二氨基－6，7－二異丙醇喋啶150mg，溶於10mL1：1的乙醇：二乙基乙醚中。把6mm大小的濾紙片浸入該溶液後取出，在空氣中晾杆，然後放在帶菌的半固體培養基上做擴散敏感試驗。
三、血清學試驗
血清學反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現肉眼可見的沉澱、凝集現象。在食品微生物檢驗中，常用血清學反應來鑑定分離到的細菌，以最終確認檢測結果。
血清學反應的一般特點：
1)抗原體的結合具有特異性，當有共同抗原體存在時，會出現交叉反應。
2)抗原體的結合是分子表面的結合，這種結合雖相當穩定，但是可逆的。
3)抗原體的結合是按一定比例進行的，只有比例適當時，才能出現可見反應。
4)血清學反應大體分為兩個階段進行，但其間無嚴格界限。第一階段為抗原體特異性結合階段，反應速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢，但不出現肉眼可見現象。第二階段為抗原體反應的可見階段，表現為凝集、沉澱、補體結合反應等。反應速度慢，需幾分、幾十分以至更長時間。而且，在第二階段反應中，電解質、PH、溫度等環境因素的變化，都直接影響血清學反應的結果。
習慣上將經典的血清學反應分三種類別：凝集反應、沉澱反應和補體結合反應。
１、凝集反應
顆粒性抗原（細菌、紅細胞等）與相應抗體結合，在電解質參與下所形成的肉眼可見的凝集現象，稱為凝集反應（Agglutination reaction）。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反應中，因為單位體積抗體量大，做定量實驗時，應稀釋抗體。
１）直接凝集反應
顆粒性抗原與相應抗體直接結合所出現的反應，稱為直接凝集反應(Direct agglution reaction)。
a.玻片凝集法。是一種常規的定性試驗方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用於鑑定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數分種後若出現肉眼可見的凝集塊，即陽性反應，證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便，但不能進行定量測定。
b.試管凝集法。是一種定量試驗方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應抗體及其含量。常用於協助診斷某些傳染病及進行流行病學調查。如肥達氏反應就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗。因為要測定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然後加入等量抗原，37℃或56℃，2~4小時觀察，血清最高稀釋度仍有明顯凝集現象的，為該抗血清的凝集效價。
２）間接凝集反應
將可溶性抗原（抗體）先吸附在一種與免疫無關的，顆粒狀微球表面，然後與相應抗體（抗原）作用，在有電解質存在的條件下，即可發生凝集，稱為間接凝集反應(Indirect agglutination)。由於載體增大了可溶性抗原的反應面積。當載體上有少量抗原與抗體結合。就出現肉眼可見的反應，敏感性很高。
２、沉澱反應
可溶性抗原與相應抗體結合，在有適量電解質存在下，經過一定時間，形成肉眼可見的沉澱物，稱為沉澱反應（Precipitation）。反應中的抗原稱為沉澱原，抗體為沉澱素。由於在單位體積內抗原量大，為了不使抗原過剩，故應稀釋抗原，並以抗原的稀釋度作為沉澱反應的效價。
１）環狀沉澱反應：是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特製小試管中，然後沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應，則在兩液介面出現白色的沉澱圓環。
２）絮狀沉澱反應：將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內混勻，如抗原抗體對應，而又二者比例適當時，會出現肉眼可見的絮狀沉澱，此為陽性反應。
３）瓊脂擴散試驗：利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內擴散，若抗原抗體對應，且二者比例合適，在其擴散的某一部分就會出現白色的沉澱線。每對抗原抗體可形成一條沉澱線。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉澱線。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種型別。單向擴散是一種定量試驗。可用於免疫蛋白含量的測定。而雙向擴散多用於定性試驗。由於方法簡便易行，常用於測定分析和鑑定複雜的抗原成分。
３、補體結合反應
補體結合反應(Complement fixation reaction)是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統的抗原抗體反應。補體無特異性，能與任何一組抗原抗體複合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的複合物結合，就會出現溶血現象，如果與細菌及相應抗體複合物結合，就會出現溶菌現象。因此，整個試驗需要有補體、待檢系統（已知抗體或抗原、未知抗原或抗體）及指示系統（綿羊細胞和溶血素）五種成份參加。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結合。如果出現溶菌，是補體與待檢系統結合的結果，說明抗原抗體是相對應的，如果出現溶血，說明抗原抗體不相對應。此反應操作複雜，敏感性高，特異性強，能測出少量抗原和抗體，所以應用範圍較廣。
