今天推送的文章是2021年8月發表在Scientific Reports上的“Improve thermostability
of Bacillus sp. TS chitosanase through structure
‑based alignment”，通訊作者是中山大學南方學院的Wang Xiao。
殼聚糖酶是一種能降解殼聚糖併產生殼寡糖的酶。殼寡糖具有廣泛的生物活性。殼寡糖在醫學領域有許多潛在的應用，包括作為腫瘤生長和轉移的抑制劑，抗哮喘的炎症治療，促進骨組織形成，傷口癒合加速劑和抗菌，抗真菌和抗瘧疾劑。殼聚糖的降解需要裂解其單體間的β-1，4-糖苷鍵。殼聚糖酶的熱穩定性是其工業適用性的關鍵；耐熱的殼聚糖酶有利於殼聚糖的生物轉化，因為它提高了反應速度，降低了底物粘度，並將微生物汙染的風險降至最低，而且減少了加酶量，降低了生產成本，增加了工業化生產過程的靈活性。
在此之前，作者曾在大腸桿菌中克隆並過表達了芽孢桿菌的殼聚糖酶基因，並對其酶學性質進行了表徵。該重組CsnTS屬於GH-8家族，以(GlcN)3-6為主要水解產物，在60°C、pH5.0時活性最高。原則上，這些特性將使CsnTS成為適合工業應用的候選材料。然而，CsnTS在60°C以上變得不穩定。因此，提高CsnTS的熱穩定性對於使該體系用於工業產品(如大規模生產甲殼低聚糖)至關重要。為了進一步提高芽孢桿菌殼聚糖酶的熱穩定性(其半衰期為5.32 min) ，作者透過與熱纖梭菌內切葡聚糖酶CelA的結構比較，確定了特異性絲氨酸殘基的突變。此外，作者研究了組合突變的協同效應，觀察到所有雙突變體和三突變體都比野生型和單突變體更穩定。最後，透過對三維結構的比較分析，探討了提高熱穩定性的機理。
熱纖梭菌是一種嗜熱菌。其最適酶解溫度為75°C。作者對CsnTS和來自熱纖梭菌的CelA的結構進行了比對，以便為後續的突變工程確定潛在的靶殘基(圖1)。選擇15個絲氨酸殘基，突變為丙氨酸或甘氨酸。
圖1
突變體在大腸桿菌BL21中高效表達。收穫的細胞經超聲破碎後，裂解產物用於活性測定。對野生型CsnTS和15個突變體在熱處理前後的活性進行了測定，在55°C孵育30min後，測定了酶活性的保留率。野生型CsnTS經加熱處理後，酶活性保留率約為20%。如圖2所示，初步篩選結果表明，突變體S265G、S276A和S347G表現出增強的熱穩定性。因此，對這三個突變體進行了提純，以供進一步研究。
圖2
所有突變體以及野生型CsnTS的分子質量約為46 kDa。在60℃下測定了野生型CsnTS及其突變體的半衰期，如表2所示，野生型CsnTS的半衰期為5.32min，而3個突變體S265G、S276A和S347G的半衰期分別為34.57min、36.79min和7.2min。圖3A顯示了野生型和所有單位點突變體的溫度分佈。所有突變體都表現出比野生型CsnTS更寬的溫度穩定性範圍。值得注意的是，突變體S276A即使在80°C的高溫下也表現出70%的酶活性，而野生型酶在這個溫度下完全失去了活性。S347G的最適溫度為55℃，低於野生型。為了研究熱穩定性與蛋白質構象的關係，採用差示掃描量熱法(DSC)測定了野生型和所有突變酶的Tm值。結果如表2所示。與野生型酶62°C相比，突變體S265G和S276A的Tm值分別提高了3°C和2°C，而S347G的Tm值有所降低。突變酶的最適pH值與野生型CsnTS相同。
圖3 (A)野生型和單位點突變體 (B)野生型和多位點突變體
表2
突變體S276A和S347G的比活力分別為456U/mg和602U/mg，與野生型CsnTS的比活力566U/mg相近，而突變體S265G的比活力為279U/mg，明顯低於野生型。三個突變體的Km值均略有增加。突變體S276A的Kcat增加，突變體S265G的Kcat顯著降低。最後，S347G突變體的Kcat值與野生型CsnTS相似(表3)。
表3
有研究表明，結合兩個或更多有益的突變可以進一步提高蛋白質的熱穩定性。因此，作者從已鑑定的三個突變體中構建了突變體組合，以進一步提高CsnTS的熱穩定性。純化的組合突變體S265G/S276A、S265G/S347G、S276A/S347G和S265G/S276A/S347G在60℃時的半衰期分別為51.84min、34.62min、44.88min和55.31min(表2)。除S265G/S347G突變體外，其餘組合突變體的熱穩定性均顯著高於單一突變體。這些組合突變體的Tm值比野生型CsnTS的Tm高約6℃。此外，所有組合突變體在更寬的溫度範圍內都表現出穩定性(圖3B)；它們在45到75°C的溫度下都保持了80%的酶活性水平。值得注意的是，突變體S276A/S347G在40到80°C之間表現出最好的酶活性，最適溫度在50到65°C之間。此外，雙突變和三突變酶的最佳pH值和pH穩定性與野生型CsnTS和單位點突變相似。雖然S265G單位點突變體的酶活性顯著降低，但包括S265G在內的所有其他多位點突變體表現出與野生型CsnTS相似的催化能力。
為了更好地瞭解影響這些突變體熱穩定性的因素，作者比較了CsnTS和突變體的生成結構。正如先前證實的那樣，Ser265在內切葡聚糖酶CelA中與附近的殘基形成氫鍵。用甘氨酸取代Ser265後，突變酶的半衰期為34.57，是野生型殼聚糖酶半衰期的7倍。另一方面，與野生型相比，S265G突變體的比活力和催化能力降低。Ser265位於與底物結合位置相鄰的柔性環上(圖1)。分子內相互作用分析表明，野生型CsnTS中S265和Y267之間的相互作用被S265G突變體中G265和T268之間的相互作用所取代（圖4）。這種相互作用的變化可能會穩定環路。此外，與野生型酶相比，S265G突變體的分子內相互作用數目增加。這些相互作用降低了環的靈活性，從而提高了突變體的熱穩定性，同時導致其催化能力的喪失。這與先前觀察到的蛋白質定點突變未能同時改善熱穩定性和酶活性是一致的。S276A突變體中的Ala276-Phe335相互作用取代了野生型殼聚糖酶中的Ser276-Tyr273相互作用（圖5）。Ser/Ala276殘基位於酶活性位點的α-螺旋上，Tyr273位於同一α-螺旋末端，Phe335位於另一個α-螺旋附近。取代的分子內相互作用穩定了蛋白質的三級結構。此外，據報道，丙氨酸殘基有利於α-螺旋的穩定性。最後，作者對S265G/S276A/S347G突變體的分析表明，它的分子內相互作用表現出許多重排。值得注意的是，與那些因突變而產生的相互作用相比，更多的相互作用消失了。這可能表明，穩定蛋白質的是適當的結構安排，而不是單個的分子內相互作用。
圖4 (A) Wild-type (B) S265G
圖5 (A) Wild-type (B) S276A
整理：李嵐雪
文章資訊：
PMID: 3434919
PMCID: PMC8339078
DOI: 10.1038/s41598-021-95369-w
