16年前的The Plant Cell要做到什麼樣的深度才能發表？作者巧妙、簡單的實驗設計，透過對蛋白的定位，驗證了病原蛋白進入小麥葉肉細胞。
植物病原真菌(Pyrenophora tritici-repentis)分泌宿主選擇性毒素(host-selective toxin, HSTs)作為致病因子。不像大多數的HSTs是酶途徑的產物，至少有兩種由P. tritici-repentis單基因控制產生的毒素是蛋白質，如ToxA。宿主對這些毒素的敏感性是由每種毒素的單個基因決定的。那麼這些致病因子是怎麼運作的呢？
1.ToxA在敏感型小麥中不被蛋白酶降解
作者開發了一種簡單的方法來確定ToxA匯入葉片的質外體後是否仍在細胞外;如果ToxA作用於細胞外，它應該可以被細胞外蛋白酶消化。因此，將敏感和非敏感小麥品種分別用異源表達的n端his-tag ToxA (His-ToxA)處理2 h，然後用蛋白酶K(PK)處理。隨後對敏感葉片進行PK處理(ToxA/PK)會導致與不使用蛋白酶的ToxA處理相似的壞死(圖1A)，表明細胞外ToxA暴露2h足以引起細胞死亡。如預期的那樣，在ToxA處理過的不敏感葉片中沒有檢測到細胞死亡的症狀(圖1A)。PK單獨處理對敏感或不敏感品種均無影響。
為了確定是否透過蛋白酶處理降解了ToxA，我們用鎳珠從ToxA/pk處理的葉片的全細胞裂解液中提取了His-ToxA。使用抗ToxA抗體對鎳珠洗脫物進行蛋白凝膠印跡分析，表明在PK處理後，敏感葉片的總裂解液中仍然存在完整的ToxA，但在不敏感葉片中幾乎檢測不到(圖1B)。這表明，只有在敏感葉片中，ToxA才受到細胞外蛋白酶的保護。蛋白凝膠印跡檢測到的His-ToxA大小與用於處理的ToxA大小相同;因此，ToxA似乎沒有在植物中被加工。對內源的ToxA也得到了類似的結果。ToxA在敏感葉片中受保護不降解表明，它要麼被內化，要麼與被受體緊密的結合，以至於蛋白酶無法接近它。
圖1 ToxA敏感葉片對PK降解有保護作用。
2. ToxA蛋白免疫定位
為了確定ToxA是否內化在敏感細胞中，將敏感和不敏感的小麥用水或天然ToxA處理4小時，並製備薄片進行免疫定位。切片用抗ToxA抗體和Alexa 488標記的二抗進行染色，並用共聚焦顯微鏡觀察葉綠體自身熒光(品紅)和ToxA標記(綠色)。在水處理的不敏感區(圖2A)或敏感區(圖2B)或ToxA處理的不敏感區(圖2C)中檢測到的標記非常少。然而，在ToxA處理過的敏感小麥中廣泛標記(圖2D)，這說明ToxA存在於細胞質和質膜內部，偶爾以大量聚集的形式存在(圖2D，實心箭頭)。還發現ToxA與葉綠體有關(圖2D，空心箭頭)。葉肉細胞膜(圖2A~2D)、表皮細胞膜(圖2A、2B和2D)和維管組織(圖2B和2C)中的綠色熒光是由於在處理和未處理的組織中可見的自身熒光，而不是由於ToxA處理。在ToxA處理過的敏感和不敏感小麥中，質膜完好無損(圖2C和2D);因此，ToxA不會因為植物細胞膜對其內化而降解。另外兩種不同的ToxA特異性抗體也觀察到類似的定位模式。因此，在敏感小麥中，ToxA蛋白酶的保護是透過內化而不是受體結合造成的。
圖2 敏感小麥和不敏感小麥中ToxA的免疫定位。
3. ToxA融合綠色熒光蛋白處理敏感和不敏感小麥
作者運用了綠色熒光蛋白ToxA融合蛋白(GFP-ToxA)，進一步確定體內ToxA在細胞內積聚的位置。同時，實驗結果也表明ToxA進入細胞時沒有破壞細胞膜。ToxA進入細胞的機制足夠強大，可以攜帶GFP融合標籤。GFP-ToxA在敏感的葉肉細胞內持續數小時，然後細胞迅速死亡。ToxA剛進入階段，由於細胞形態正常且未受干擾，細胞膜完整性和細胞結構似乎沒有因ToxA進入敏感細胞而發生改變（圖3）。
圖3 GFP-ToxA融合蛋白在敏感和不敏感小麥中的定位。
光啟用4. ToxA
ToxA定位於葉綠體的研究表明，光誘導的葉綠體功能可能是ToxA活性的必要條件。為了驗證這一點，作者用天然的ToxA或GFP-ToxA融合蛋白侵染敏感型小麥葉片，並在侵染區覆蓋一個區域以遮擋光線。遮光幾乎消除了ToxA誘導的組織塌陷和壞死，而在未覆蓋的葉片區域，由ToxA和GFP-ToxA產生的壞死，說明該區域ToxA是活躍的。因此，ToxA和GFP-ToxA都需要光來誘導壞死（圖4）。
圖4 ToxA活性依賴於光。
5. 植物細胞表達ToxA導致細胞死亡
ToxA進入敏感植物細胞並不表明ToxA內化是其毒性的必需條件;細胞外ToxA引發的訊號可能是細胞死亡的原因。如果ToxA的內化是必需的，並且足夠誘導壞死，那麼敏感的小麥細胞表達ToxA應該導致細胞死亡。基因槍技術已被用於證明一些由植物病原體產生的細胞死亡誘導蛋白有一個內部作用位點，利用ToxA(負訊號序列)和β-葡萄糖醛酸酶(GUS)表達質粒共轉化敏感和不敏感小麥品種。在本實驗中，如果細胞因弓形蟲的表達而死亡，則顯示GUS活性的細胞將少於與GUS和對照質粒共轉化的細胞。在敏感小麥和不敏感小麥中，ToxA與GUS共表達導致GUS表達細胞數量比對照減少50%，如果有內化作用位點這個數值則在預期範圍內。敏感細胞和不敏感細胞對ToxA內部表達的結果類似表明，不僅ToxA內化是毒性反應的必要和充分條件，而且細胞內化ToxA的能力是區分敏感和不敏感的因素（圖5）。
圖5 ToxA在敏感和不敏感的小麥品種中表達都導致細胞死亡。
總的來說，免疫定位和綠色熒光蛋白標記的ToxA定位表明，ToxA只在敏感小麥品種中內化。一旦被內化，ToxA就定位於細胞質室和葉綠體。ToxA透過基因槍在ToxA敏感細胞和ToxA不敏感細胞的細胞內表達導致細胞死亡，這表明ToxA在兩種細胞中都存在作用位點。然而，由於ToxA只在敏感品種中內化，因此ToxA敏感性和ToxA敏感性基因很可能與蛋白質輸入有關。同時研究結果表明，在沒有病原菌的情況下，ToxA蛋白能夠從植物質膜的質外體空間穿越到植物細胞內部。
原文連結：
https://academic.oup.com/plcell/article/17/11/3203/6114754?searchresult=1
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