神經細胞像電路一樣連線在一起，透過刺激神經細胞能夠影響動物的行為和運動。研究人員使用各種工具來研究線蟲、果蠅和斑馬魚等模式生物中的神經網路。訣竅是啟用一些神經細胞，而不是其他神經細胞，以便隔離它們在神經迴路中的特定作用。為此，常用的方法是透過組織特異性啟動子作用於靶向細胞群，如UAS/Gal4系統。然而，這種方法只能提供有限的精確度，並且在許多情況下沒有合適的啟動子；特別是在研究人員旨在將表達限制在單個細胞或定義的細胞子集的情況下。
該研究中，作者發明的LaserTAC系統可利用光操縱單個細胞（如神經元）中的基因活動。該方法透過構建光籠版本的酶Cre重組酶來實現，當細胞用紫外線照射時，一部分氨基酸被去除，從而使Cre重組酶開啟其目標基因。這使研究人員能夠精確控制特定基因在哪些細胞中以及何時開啟或關閉。此外，隨著遺傳密碼擴充套件效率的提高，該技術還可用於修飾除Cre重組酶以外的蛋白質，並應用於近年來開發的其他人工氨基酸，該研究成果發表在《eLife》上。
最佳化ncAA（非經典氨基酸）的參入
得益於遺傳密碼擴充套件（genetic code expansion），研究人員能夠在翻譯過程中將一些功能引入蛋白質，這些功能是常規的、天然存在的氨基酸所不具備的。透過表達特定的氨醯-tRNA合成酶(aaRS)及其特異識別的tRNA來實現的，其中tRNA上帶有確定非規範氨基酸(ncAA)的摻入位點的密碼子。有效的遺傳密碼擴充套件取決於氨醯-tRNA合成酶氨醯化其同源tRNACUA的能力，後者反過來將 ncAA 傳遞到核糖體，以響應 UAG 琥珀終止密碼子（圖 1A）。
圖1. 遺傳密碼擴充套件和 LaserTAC
來自古細菌Methanosarcina物種的正交吡咯賴氨醯-tRNA合成酶(PylRS)/tRNA(Pyl)對是最通用和廣泛使用的遺傳密碼擴充套件對。該研究中，作者採用一個吡咯賴氨醯-tRNA合成酶的變體--PCKRS，並透過基因改造在其N端加入一個強出核訊號（S-NES），使其大量停留在細胞質中，因為蛋白質的合成在細胞質中。為了測定PCK摻入效率，作者使用了雙色摻入感測器；普遍表達的GFP::mCherry融合，兩個熒光團編碼序列由琥珀終止密碼子（UAG）分隔（圖2B）。不存在光籠賴氨酸（PCK）時，翻譯將在琥珀終止密碼子處終止，導致僅產生GFP。相反，在存在PCK的情況下，tRNA(Pyl)CUA帶有ncAA並充當無義抑制因子，從而產生全長GFP::mCherry融合蛋白。實驗結果表明，所有檢測的NES都使PCKRS從細胞核輸出到細胞質（圖2D）。其中，PKIα-NES和Smad4-NES大大提高了PCK的摻入效率（圖2C），因此作者選擇了這兩個最有效的PCKRS變體用於後續實驗。同時，作者還優化了tRNA(Pyl)，作者發現C15變體的存在顯著提高了摻入效率（圖2C、E、F和G）。
圖2. 使用 NES::PCKRS變體和tRNA(C15)提高了秀麗隱杆線蟲中遺傳密碼擴充套件的效率
光籠化Cre重組酶的表達及最佳化
作者接下來改造Cre重組酶，Cre 重組酶可以透過用PCK（光籠賴氨酸） 替換 K201（該賴氨酸對Cre酶活性至關重要）進行光籠化，獲得表達光籠化Cre重組酶(PC-Cre)的線蟲品系。在沒有光照的情況下，該Cre沒有活性；當經365 nm光照後，PCK上的部分基團丟失，Cre被活化（圖3A, B, C）。啟用的Cre能夠切割基因組上的兩個loxP位點，是目的基因前的終止子丟失，從而啟用目的基因的表達（圖3C）。作者構建了包含所有LaserTAC系統所需遺傳成分的轉基因品系：最佳化的PylRS/tRNA對Smad4-NES::PCKRS/tRNA(C15)、PC-Cre和Cre靶標基因ChR2::mKate2。作者從L1幼蟲階段開始，將幼蟲放在含PCK的培養基上培養，並在它們達到L4幼蟲階段（2天后）時透過紫外線照射啟用PC-Cre（圖3A）。啟用後24小時，作者看到ChR2::mKate2在表達PC-Cre的神經元中強烈表達。為了進一步改進光活化方法，作者接下來轉向PC-Cre最佳化。為此，作者透過引入點突變使內部NLS序列失活，同時還去除N端SV40NLS。為了僅恢復全長PC-Cre的入核效率，作者將線蟲強EGL-13如何訊號太附加到Cre的C末端，獲得最佳化的PC-Cre(optPC-Cre)（圖3E）。當作者將optPC-Cre與PC-Cre進行比較時，作者確實發現目標基因啟用得到了顯著改善：從PC-Cre的63%到optPC-Cre的97%（圖3D）。
圖3. 最佳化 PC-Cre 重組酶以在線蟲中實現遺傳密碼擴充套件
使用LaserTAC啟用特定細胞的基因表達
透過光來控制Cre重組酶的活性應該允許對依賴於Cre的DNA重組進行精確的空間控制。作者透過使用安裝在顯微鏡上的365nm鐳射靶向觸摸響應迴路中的單個細胞，以此來測試LaserTAC啟用基因表達的精度。線蟲有六個機械感覺神經元，用於感知軟觸控：AVM、ALML和ALMR，位於蠕蟲的前部，以及PVM、PLML和PLMR，位於蠕蟲的後部（圖4A），觸控感受器神經元的啟用導致迴避行為。12-24小時後，作者觀察到僅存在於鐳射靶向細胞中的Chrimson::mKate2表達。作者能夠在兩個PLM神經元以及單獨的PLML或PLMR中選擇性地啟用optPC-Cre（圖4C-E）。
圖4. 使用最佳化的光籠化Cre重組酶的LaserTAC促進了線蟲特定細胞中光遺傳學通道的表達
總結
綜上所述，這些發現表明，LaserTAC系統可用於利用光操縱單個細胞（如神經元）中的基因活動。它使研究人員能夠精確控制特定基因在哪些細胞中以及何時開啟或關閉。此外，隨著遺傳密碼擴充套件效率的提高，該技術可用於修飾除Cre重組酶以外的蛋白質，並應用於近年來開發的其他人工氨基酸。
原文連結：
https://elifesciences.org/articles/67075
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