福爾馬林固定石蠟包埋 (Formalin Fixed Paraffin Embedded, FFPE) 樣本具有數量多、穩定性高和隨訪資訊完整等特點，成為回顧性癌症研究中極具吸引力的寶貴資源。隨著蛋白質組學技術的發展，尤其是4D蛋白質組學的應用，基於FFPE樣本的蛋白質組學技術已廣泛運用於癌症等疾病研究，極大的推動了疾病的臨床過程和疾病機理研究 [1、2、3]。例如華中科技大學同濟醫學院等合作團隊運用景傑生物4D蛋白質組學分析，針對新冠肺炎病毒患者的肺組織FFPE樣本進行深度定量，揭示了新冠病毒肺炎免疫應答以及炎症反應調控機制與關鍵蛋白（PNAS, 2020）。與蛋白質組學相比，修飾組學定量分析對樣本量需求更高，針對FFPE樣本的修飾組學目前仍然具有非常大的挑戰。
近日，國際權威期刊Nature Communications(IF=14.9)上發表題為“Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories” 的研究文章。研究針對非小細胞肺癌 (NSCLC) 的FFPE樣本，進行了蛋白質組學、磷酸化修飾組學定量分析，為深入瞭解肺癌和其他型別癌症的發病機制提供了幫助。研究結果同時也突顯了FFPE樣本進行無偏修飾組學分析的巨大前景，有望對癌症的臨床程序做出新的解釋。
01FFPE樣本磷酸化修飾組分析的蛋白質提取
從福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本中提取蛋白是修飾組學分析的關鍵。研究人員用非小細胞肺癌（NCSLC）FFPE樣本比較了三種已發表的蛋白質提取方案（SDS、SDC和RapiGest），結果顯示，SDS-SP3方法鑑定到的整體蛋白質組覆蓋度（2917種蛋白）、肺癌相關蛋白質組覆蓋度以及可重複性（CV值最低）均最高。此外，前變數（包括福爾馬林固定時間，解交聯所需95°C加熱時間）對蛋白質組及修飾蛋白質組並未產生顯著差別。
圖1.SDS-SP3方法提取肺癌FFPE樣本的蛋白質種類最多且與NCSLC相關性最佳
02FFPE樣本磷酸化修飾組定量策略
研究進一步對Label Free和TMT標記這兩種蛋白質組學定量常見方法進行了系統比較，發現兩者在FFPE組織分析方面有不同的優勢和劣勢。對於相同上樣量的樣本（每個肽量200 µg），TMT方法獲得的蛋白和磷酸化修飾組定量深度高於LFQ 方法，但考慮到標記、分餾和脫鹽的額外樣品處理步驟，需要相對較高的起始樣本量和更多的樣品製備時間。與之相比，LFQ只需要少量的樣本量進行定量分析和相對較短的樣品製備時間（圖2a）。因此研究人員建議，LFQ特別適合於微量樣本，以及在中等覆蓋率下研究數百個樣本的大型佇列，TMT方法適合20～200例臨床FFPE樣本，高深度定量研究（圖2b）。
圖2、FFPE樣本磷酸化修飾組定量方法推薦
03微量TMT分析方法
那麼能否減少TMT定量的樣本需求量呢？針對這個問題，研究團隊開發了一個微量TMT定量方法（microscaled TMT）。每個樣本分10個組分以提高鑑定深度。將八個活檢等效物（肽量20µg）用TMT（通道1-8）標記，並與2 mg內標物的增強通道（通道11）結合。每個增強通道有助於將訊號增加到最小丰度閾值以上，這是獲得足夠的片段離子以確定TMT標記肽的氨基酸序列和足夠的TMT報告離子以在MS2掃描中進行定量所必需的。研究在平均每個TMT-plex定量了超過7000個蛋白質和近8800個磷酸化位點（與TMT方法有近6000個磷酸化位點重疊）。
圖3、使用TMT增強劑實現微量樣本蛋白質組深度覆蓋
04微量TMT方法的臨床分析
最後，研究人員驗證了微量TMT方法對FFPE臨床穿刺活檢樣本的檢測效果。研究選擇了8例非小細胞肺癌 (NSCLC) FFPE穿刺活檢樣本，其中包括4例腺癌 (ADC) 和4例鱗狀細胞癌 (SCC)。結果顯示，從8次FFPE穿刺活檢樣本中定量了近6800種蛋白質，且具有良好的NSCLC相關蛋白的覆蓋，磷酸化修飾組最終覆蓋範圍可以達到超5200個磷酸化位點（圖4A、B）。而對比微量TMT方法在臨床活檢樣本和上文活檢等效物（肽量20µg）的檢測效率來看（圖4C、D），兩者可定量到相似數量的蛋白質（6792：7137），重疊率為78%。在磷酸化蛋白質組水平上，TMT活檢實驗中定量到的磷酸化位點數量少於活檢等效物（5243：8798），這可能是由於活檢和切除組織樣本的細胞在組成上略有不同造成的。
圖4、FFPE穿刺活檢樣本的磷酸化修飾組分析
總的來說，該研究系統性地比較了FFPE樣本（包括FFPE穿刺活檢樣本）的蛋白質提取方案、蛋白質組學定量策略和樣本量需求，提供了FFPE樣本磷酸化修飾組的多種定量方法選擇。LFQ定量特別適合研究中等覆蓋率的數百個樣本的大型臨床佇列；TMT方法可提供更深的（磷酸化修飾）蛋白質組分析，適合20～200例臨床FFPE樣本的研究。並嘗試提出改進的微量TMT方法，實現對於微量的樣本需求實現高通量、高覆蓋的磷酸化修飾組學分析。總之，本研究為深入瞭解肺癌和其他型別癌症的發病機制提供了幫助，體現了臨床治療方案的個體差異性。
景傑生物是中國最具創新活力的蛋白質組學技術應用與開發的領先者，提供多層次、全覆蓋的蛋白質組學技術，可對生物與臨床樣本進行高通量、高靈敏度的深度覆蓋蛋白質（修飾）組學技術分析，助力各位老師的研究。
·FFPE樣本：4D-FFPE蛋白組&修飾組分析·血液樣本：Blood+高深度血液蛋白組定量·單細胞樣本：真·單細胞蛋白質組學·高深度定量：TMT高深度蛋白組&磷酸化修飾組分析
參考文獻：1.Fabian Coscia,etal.,2019,A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large scale FFPE tissue analysis. bioRxio.
2.Monika Oberhuber, et al., 2020,STAT3-dependent analysis revealsPDK4 as independent predictor of recurrence in prostate cancer. Molecular Systems Biology.
3.Meng Wu, et al., 2020, Transcriptional and proteomic insights into the host response in fatal COVID-19 cases. Proc Natl Acad Sci U S A.
4.Corinna Friedrich, et al., 2021, Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories. Nature Communications.
