隨著嵌合抗原受體工程化T 細胞（CAR-T）在治療血液腫瘤方面的巨大成功，開發CAR工程化自然殺傷細胞（CAR-NK）的興趣迅速增長。本文著眼於CAR-NK細胞基因工程設計和臨床應用的進展，討論當前挑戰和未來前景。
NK細胞占人類外周血白細胞的5%~15％，表達CD56，不表達CD3和T細胞受體（TCR）。人NK細胞可根據CD56和CD16（Fcγ受體Ⅲ或FcγRⅢ）的表達進一步分為兩個亞組：CD56dim CD16high NK細胞和CD56bright CD16low/- NK細胞。CD56dim CD16high NK 細胞佔外周血NK細胞的85%～95%，發育成熟，細胞毒性強，CD56bright CD16low/- NK細胞發育不成熟，細胞毒性低。
NK細胞發育不進行體細胞基因重排，不表達抗原特異性受體，是一種非特異性腫瘤殺傷細胞。NK細胞受一系列啟用和抑制受體訊號調控，其殺傷力取決於抑制訊號和啟用訊號之間的平衡。HLA低表達的腫瘤細胞由於KIR介導的抑制作用下降而更易於被NK細胞殺傷。
NK細胞還透過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）殺傷靶細胞。NK細胞膜上的CD16可識別與靶細胞表面結合IgG的Fc部分，透過ITAM訊號途徑啟用NK細胞，透過多種途徑誘導靶細胞凋亡（如釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質殺傷靶細胞，Fas/FasL、TNF-α/TNFR-I介導靶細胞凋亡等）。活化的NK細胞還分泌各種細胞因子和趨化因子，進一步募集並活化其他免疫細胞，如T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞。
1. CAR-NK細胞優勢
過繼細胞療法旨在利用人體免疫系統消除癌症。早期臨床研究顯示LAK或TIL細胞療效不夠強大。透過在免疫細胞（包括T細胞、NK細胞、NKT細胞和巨噬細胞）表達抗原特異性TCR或嵌合抗原受體（CAR）可明顯提高免疫細胞抗癌效果。與CAR-T細胞相比，CAR-NK細胞有一些顯著優勢，包括：(1)更好的安全性。未修飾的NK細胞及CAR-NK細胞安全性已在臨床研究中得到證明，如沒有細胞因子釋放綜合徵（CRS）和神經毒性，異體來源的CAR-NK不會誘發移植物抗宿主病（GVHD），這可能是由於活化的CAR-T細胞分泌IL-1α、IL-1Rα、IL-2、IL-2Rα、IL-6、TNF-α、MCP-1、IL-8、IL-10 和IL-15，與CRS 和神經毒性高度相關，而活化的NK 細胞通常分泌的是IFN-γ和GM-CSF 。(2)有多種啟用機制。除了以CAR依賴性方式殺死腫瘤靶細胞外，CAR-NK細胞具有天然的細胞毒活性，可透過非CAR依賴的機制啟用，例如NCR、NKG2D、共刺激受體DNAM-1（CD226）和KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4）。此外，NK細胞可透過CD16介導的ADCC殺傷腫瘤細胞。因此，NK細胞具有廣譜高效的殺瘤活性。(3)可生產“現貨”（off-the-shelf product） 產品。(4)可對CAR-NK細胞進行改造，使其靶向多種抗原，增加對實體瘤的浸潤，克服耐藥的腫瘤微環境，最終實現有效抗腫瘤反應。
2. CAR-NK 細胞來源
同種異體NK 細胞的低GVHD風險使CAR-NK細胞的來源多樣化，包括NK92細胞系、外周血單核細胞（PBMC）、CD34+ 造血祖細胞（HPC）、臍帶血（UCB）細胞和誘導多能幹細胞（iPSC）。
當前CAR-NK細胞臨床試驗多使用NK92細胞系，因它具有無限體外增殖能力。但作為腫瘤細胞系的NK92細胞具有固有缺陷，包括潛在的致瘤風險，缺乏CD16和NKp44表達，輸注前需要進行輻射處理，因此不是最理想細胞來源。
PBMC是原代NK細胞重要來源，細胞可來自HLA匹配或不匹配供體。PBMC衍生的CAR-NK細胞90％以上是CD56dimCD16+ NK細胞，屬於成熟細胞，表達大部分啟用受體，因此細胞毒性強，但增殖能力較弱。
UCB來源的NK細胞由於單份UCB體積有限，分離得到NK 細胞數量少，可能無法滿足臨床需要。此外UCBNK細胞不成熟，某些黏附分子、CD16、KIR、穿孔素和顆粒酶B表達較低，而抑制性分子如NKG2A的表達較高，導致活性不如PBMC 來源的CAR-NK細胞。
採用CD34+ HPC分化是獲得大量成熟NK細胞的另一種方法。可從骨髓、胚胎幹細胞、動員的PBMC或UCB中分離CD34+ HPC，然後擴增並分化為成熟的NK細胞。
由於具有無限增殖能力，iPSC已成為重要CARNK細胞來源。與分化的NK細胞相比，iPSC可更穩定表達CAR。CAR-iPSC可在含有SCF、VEGF 和BMP4的培養基中分化為HPC，然後用含有IL3、IL-15、IL-7、SCF 和FLT3L的培養液分化為CARNK細胞。但是與UCB-NK細胞相似，iPSC生的NK細胞通常具有不成熟表型，KIR和CD16表達較低而NKG2A表達較高。
綜上，CAR-NK細胞易於取材、生產，具備通用性，可根據治療需求提供現貨產品。
3. CAR 結構
大多數CAR-NK細胞研究都使用CAR-T細胞設計的CAR，少部分是針對NK細胞專門設計的CAR。含有4-1BB共刺激域（scFv-CD8TM-4-1BB-CD3ζ）的第二代抗CD19CAR 可在原代NK細胞中表達。生產的NK細胞可特異性殺傷CD19+急性淋巴細胞白血病細胞。針對HER2、EGFR或EGFR變體Ⅲ和CS1的CAR-NK也已開發出。此外，具有不同訊號傳導域（包括CD3ζ、DAP10和DAP12）的原代CAR-NK細胞或CARNK92細胞也有報道。
4. CAR 基因轉染方法
開發CAR-NK細胞的主要障礙之一是原代NK細胞缺乏有效基因轉染方法。
逆轉錄病毒載體轉染NK細胞效率為27％~52％。編碼分泌型IL-15或膜結合型IL-15（mIL-15）基因的逆轉錄病毒的轉導效率可達70％，然而這種方法有兩個弊端：一是病毒可插入到基因組，導致細胞癌變；二是逆轉錄病毒轉染會抑制原代NK細胞活力。
慢病毒具有較低遺傳毒性和插入誘變作用，但慢病毒在原代NK細胞中的轉導效率很低，通常需要多輪轉導。修飾的狒狒包膜糖蛋白（BaEVgp）假型化的慢病毒載體可提高轉染效率。同樣，用長臂猿猿猴白血病病毒的包膜蛋白假型化的慢病毒也能有效地轉導原代NK細胞。
電穿孔和脂質體轉染也可將外源基因有效傳入NK細胞，而且轉入的基因表達快， 細胞凋亡水平較低，個體間變異性較小。但電穿孔和脂質體轉染的外源DNA不會整合到靶細胞的基因組中，因此轉基因的表達是瞬時。
DNA轉座子是可移動的DNA元件， 可透過“ 剪下和貼上”機制在載體和染色體之間有效轉座，產生穩定表達CAR分子的CAR-iPSC-NK細胞。PiggyBac（PB）和“ 睡美人”（SB）是兩個最常用轉座子系統，由兩個部分組成：介導“剪下和貼上”功能的轉座酶和側接兩個末端反向重複序列（TIR）的DNA載體。與病毒載體相比，這些轉座子系統具有多個優勢，如免疫原性低、生物安全性高、生產成本低及具有轉導長度大於100 kb大基因片段的能力。然而轉座子系統在轉導原代NK細胞中的適用性仍需要進一步完善，以克服低轉導效率和質粒DNA電穿孔導致NK細胞死亡等缺點。
因此，開發有效基因轉染方法是未來CAR-NK細胞的研究重點。
5. 體外擴增CAR-NK 細胞
NK細胞僅佔PBMC一小部分，因此擴增足夠數量NK細胞仍然是主要挑戰。IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18是常用的體外原代NK細胞擴增因子，但擴增效率不夠高。採用與刺激性細胞共培養的方法比細胞因子的擴增效率高。常用的刺激細胞包括Wilms腫瘤細胞系、自體PBMC、EB 病毒轉化的淋巴母細胞、K562細胞、表達mIL-15 或4-1BB配體（4-1BBL）的K562 細胞、共表達mIL-15 和4-1BBL的K562細胞等。但這些飼養細胞啟用的原代NK細胞連續增殖8~15周後會發生衰老。腫瘤細胞在與NK細胞共培養之前則必須經過照射，以確保最終產品中沒有存活的飼養細胞。表達mIL-15的NK細胞在體外和體內均表現出優異增殖和存活率，並對腫瘤細胞具有更高細胞毒性。總體上目前還缺乏高效、安全的NK細胞體外擴增方法。
6. CAR-NK 細胞臨床應用
CAR-NK細胞臨床研究還處於早期階段。2016年之前只開展了2項試驗（NCT01974479、NCT00995137），至今仍在進行中。2016年之後進入臨床研究的CAR-NK細胞專案明顯增加，目前有19項研究已在Clinicaltrials.gov 中註冊，其中11項靶向造血系統惡性腫瘤，針對抗原包括CD19、CD22、BCMA、CD33和CD7。針對轉移性實體瘤的試驗中，靶向抗原包括HER2、PSMA、間皮素、ROBO1、MUC1和NKG2DL。4項原代NK細胞的研究中有3項使用mRNA 電穿孔介導瞬時CAR表達。這些試驗中僅3項發表了研究結果。其中編號為NCT03056339的臨床研究納入11名高危CD19+ B細胞惡性腫瘤患者，在接受UCB衍生的CAR-NK細胞移植後11位患者中有7 位完全緩解，而且未出現嚴重副作用。
Fate Therapeutics 公司開展的Ⅰ期臨床試驗（NCT04245722）採用iPSC製備CAR-NK細胞（代號FT596），用於治療CD19+B 細胞惡性腫瘤。FT596表達3種蛋白：CD19-CAR、高親和力CD16及IL-15受體融合蛋白。自分泌IL-15可支援CAR-NK細胞在體內長久存活。當FT596與治療性抗體一起使用時可有效克服由於CD19抗原丟失而引起的腫瘤細胞抵抗。
7. CAR-NK 細胞未來研究方向
與CAR-T細胞不同，CAR-NK細胞可透過非CAR依賴性方式殺傷癌細胞。因此。可研發不表達活化訊號的CAR，該CAR雖然不會誘導直接靶細胞殺傷，但會促進NK細胞黏附靶細胞，觸發NK 細胞自然殺傷機制，而不會殺傷表達相同抗原的正常細胞。
使用先進基因工程技術使NK細胞同時表達其他細胞因子、抗體和蛋白酶等，從而促進其增殖、遷移和浸潤，或改善腫瘤微環境。
與T細胞一樣，活化NK細胞也表達一些T 細胞免疫檢查點分子（如PD-1、CTLA-4、LAG3 和TIM3），它們可能會抑制NK抗腫瘤活性。因此，透過基因編輯敲除檢查點分子也是提高CAR-NK活性的途徑。
NK細胞表達CD16併發揮ADCC介導的腫瘤殺傷作用。但細胞因子的啟用或靶細胞刺激通常會導致NK細胞CD16表達明顯下降。對NK細胞進行基因改造，使其穩定表達CD16可提高CAR-NK活性。
總之，CAR-NK細胞作為一種新型的癌症細胞免疫療法將提高癌症患者的生存率，具有廣闊的前景。
