撰文 | 言笑
1947年，Mandel和Metais首次報道了外周血中存在遊離DNA（Cell-free DNA, cfDNA）。正常生理狀態下，血液中的cfDNA主要來源於白細胞的壞死和凋亡；在某些疾病和特殊狀態下，如組織損傷、癌症和炎症反應等，細胞內的DNA片段也會被釋放到各種體液中（血漿、腦脊液、尿液等）成為cfDNA。在癌症早期，當患者還未表現出明顯的臨床症狀時，細胞內DNA狀態就已經發生變化，這些DNA被釋放到體液中，使得體液cfDNA中包含了與癌症相關的重要資訊。透過對這些資訊進行提取和處理，可對癌症進行非侵入式診斷，實現癌症的早期診療，因此，cfDNA檢測是目前市場上最常見的液體活檢形式。
髓母細胞瘤（Medulloblastoma，MB）是一種惡性的兒童胚胎中樞神經系統腫瘤，具有沿軟腦膜轉移的傾向。根據基因組特徵可分為4個亞群：WNT、SHH、 Group 3和Group 4。手術切除結合放化療是目前治療MB的首選治療方案（可治療約70%的病人），術後的標本則作為診斷和腫瘤特徵分析的證據。MB能夠隨著時間的推移而發展，約1/3患有MB的兒童最終都是死於該疾病，存活下來的患者也需要長期忍受由於治療而產生的毒性。目前，除了磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）和腦脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）細胞學檢測，還沒有可靠的分子生物標誌物來反應MB的進展情況。因此，透過縱向樣本開發強大的、微創的、臨床可操作的生物標誌物是非常必要的。
研究顯示，在 CNS 惡性腫瘤患者中，CSF來源的cfDNA比從血漿中分離出來的cfDNA具有更大的效用【1-2】。MB基因組幾乎沒有熱點驅動突變，而是以普遍的染色體複製數變異（Copy number variations, CNVs）為特徵，因此限制了cfDNA 突變分析在MB中的通用性【2-3】。
近日，來自美國St. Jude兒童研究醫院的Paul A. Northcott團隊在Cancer Cell雜誌線上發表了題為Serial assessment of measurable residual disease in medulloblastoma liquid biopsies的文章。研究人員利用MB中染色體不穩定性的特點，透過低深度全基因組測序（Low-coverage whole-genome sequencing, Lc-WGS）對來自123名MB患者的476例CSF來源的cfDNA樣本進行分析，鑑定了可作為可測量殘留病變（Measurable Residual Disease, MRD）標誌物的CNVs，闡釋了cfDNA檢測的疾病預測價值和診斷價值。
本研究共收集了來自123名MB患者的共476例CSF樣本，提取cfDNA進行低深度全基因組測序（lcWGS），並進行後續分析（圖1）。首先，作者評估了cfDNA來源的CNVs作為MRD標誌物的效用。資料顯示，在67例樣本（67/105）中檢測到了MRD；相反，7例非腫瘤CSF樣本中都沒有檢測到cfDNA來源的CNVs，即MRD陰性。MRD陽性CSF樣本與相應的原發性腫瘤之間的CNVs檢測譜高度一致。MRD檢測與疾病的轉移狀態、分子亞群和腫瘤位置顯著相關，與年齡、性別、切除範圍、細胞學檢查結果以及切除和腦脊液取樣之間的時間無關。值得注意的是，無論相應的腦脊液細胞學結果如何，MRD在高危疾病患者中的陽性率相似：91例腦脊液細胞學陰性的樣本中有56例樣本的MRD呈陽性。
圖1. 樣品收集及檢測流程圖
隨後，作者探究了連續MRD檢測與疾病復發之間的關係。在30/77（39%）例放療後、21/75（28%）例化療中及20/68（34%）例治療結束的患者中檢測到MRD。出現疾病復發的患者在治療期間的MRD持續率明顯高於沒有復發的患者。在MRI顯示病情完全緩解的32例病人中，有16例病人在復發前3個月時就檢測到了MRD，此時影像學或細胞學異常還不能檢測到。在所有持續接受放化療或細胞學有差異的12例病人的CSF樣本（n=27）中均檢測到了MRD。24/25例患者在病情發展的3個月內採集的腦脊液標本中MRD呈陽性；在病情沒有進展的患者中，193/209（92%）例CSF樣本都是MRD陰性。
那麼，連續檢測MRD在臨床上有何價值？作者發現，那些放化療後、治療期間或已經結束治療的病人中，MRD陽性病人的無進展生存期（progression-free survival, PFS）比MRD陰性的病人差很多。與治療結束時MRI和腦脊液細胞學檢查的標準評價進行比較，同時進行的MRD檢測對於病人分類更有效，其對殘留病變的靈敏度也更高（64% vs. 24%）。在治療結束的病人中，12/20（60%）MRD-陽性的病人的MRI/細胞學檢查正常，但後期其中的10位病人的病情都有所進展；其餘兩例病人MRI正常其MRD也呈陽性。在高風險患者中，治療結束時的MRD與PFS有顯著關係。作為一個隨時間變化的變數，隨訪期間MRD檢測與PFS顯著相關。
接下來，作者對疾病復發中的腫瘤相關分子圖譜進行了分析。為了同時在早期和疾病進展期檢測漸進性疾病（Progressive disease, PD）和MRD陽性患者的CSF，作者比較了從患者匹配的CSF樣本中提取的CNVs譜，發現了染色體非整倍性，提示12/15（80%）例患者存在克隆選擇或進化。cfDNA 分析可以更早地檢測出那些在疾病復發時占主導地位的腫瘤克隆。在研究過程中，作者也注意到了原位腫瘤與cfDNA中檢測到的CNVs不一致的情況。例如，患者sj024被診斷為Group4髓母細胞瘤，隨後又出現轉移性骨骼復發。然而與相應的原位腫瘤CNV檢測結果相比，患者的cfDNA來源的CNVs譜更符合復發腫瘤特性，提示患者的CSF樣本中包含了具有侵略性的亞克隆，可以驅動疾病的進展。
最後，作者進一步評估了基於 lcWGS 的 cfDNA 分析在其他兒童腦腫瘤中的適用性。透過對17名非髓母細胞瘤患者進行分析，發現所有患者在其相應的原發腫瘤中都存在染色體和/或局灶性CNVs。基於lcWGS分析CSF來源cfDNA顯示，13例（76%）樣本呈MRD陽性，包括3例轉移樣本。此外，作者還觀察了與臨床過程相呼應的cfDNA樣本的分子反應，其與MB中的發現類似。
綜上所述，該研究利用從MB和其他CNS腫瘤患者收集的腦脊液樣本的大型縱向佇列，首次有效地、系統地論證了CSF來源的cfDNA譜在兒童CNS癌症中檢測MRD的臨床效用（圖2）。雖然液體活檢的種類和方式非常豐富，但作者認為使用lcWGS檢測CSF來源的cfDNA中的腫瘤相關CNVs非常適合於MB：（1）MB切除後患者腦脊液或血漿中cfDNA的含量明顯低於其他腦腫瘤患者【4-5】，這種低於毫微克的產物，若採用其他檢測方法（如表觀遺傳組和突變分析）是極具挑戰的，但對lcWGS已經足夠；（2）染色體CNVs在兒童MB中幾乎無處不在，捕獲CNVs無需使用定製探針來靶向不同的突變驅動基因，適用於缺乏已知驅動基因突變的MB樣本。該研究支援將前瞻性cfDNA評估納入MB臨床試驗，以進行進一步的研究和技術改進，最終實現根據MRD反應進行個性化治療。
圖2. cfDNA檢測流程及臨床效用
原文連結:
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.012
製版人：十一
參考文獻
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[2] Escudero, L., Llort, A., Arias, A., et al. (2020). Circulating tumour DNA from the cerebrospinal fluid allows the characterization and monitoring of medulloblastoma. Nat. Commun. 11, 1–11.
[3] Northcott, P.A., Buchhalter, I., Morrissy, A.S., et al. (2017). The whole-genome landscape of medulloblastoma subtypes. Nature 547, 311–317.
[4] Diaz, L.A., Jr., and Bardelli, A. (2014). Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579.
[5] Wang, Y., Springer, S., Zhang, M., et al. (2015). Detection of tumorderived DNA in cerebrospinal fluid of patients with primary tumors of the brain and spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 9704–9709.
